Desenvolvimento de linhagens TcI e TcII de Trypanosoma cruzi expressando proteínas fluorescentes para estudo da interação parasito-hospedeiro

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.Surtos de doença de Chagas aguda associados à transmissão pela via oral têm sido reportados no Brasil e em outros países da América do Sul. Contudo, estudos sobre a dinâmica da infecção por via oral ainda são incipientes. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a interação in vitro e in vivo de linhagens transfectadas de T. cruzi TcI e TcII com plasmídeos pTREXRFP/GFPNeo e pROCKGFPNeo. Para tanto, foram geradas linhagens da cepa SC25 (TcI) e SC96 (TcII) expressando de maneira estável as proteínas fluorescentes RFPe GFP, respectivamente. A cepa Y expressando GFP foi utilizada em ensaios de interação parasito-hospedeiro. Estudos in vitro mostraram que a transfecção não alterou o crescimento e a capacidade de infecção das cepas. Ensaios de co-infecção em células THP-1 mostraram que misturas de parasitos TcI e TcII em diferentes proporções apresentaram níveis de infecção inferiores aos observados para as cepas em infecções isoladas eque uma mesma célula comporta a infecção pelas duas linhagens de parasitos. Triatomíneos infectados isoladamente com cada uma das cepas transfectadas apresentaram taxa de infecção semelhante. Contrariamente, infecções mistas nos insetos mostraram um predomínio de parasitos da linhagem TcII. Em camundongos a infecção pela via oral da cepa TcI não foi capaz de induzir parasitemia sanguínea detectável nos animais. Por outro lado, a cepa YGFP ocasionou parasitemia sanguínea patente e nas inoculações com misturas de TcI e TcII, apenas parasitos TcII foram detectados no sangue e tecidos de animais infectados. O tratamento de tripomastigotas da cepa SC25RFP com pepsina reduziu significativamente sua capacidade de infecção em células THP-1, sugerindo que a passagem pelo ambiente gástrico pode ter interferido negativamente na infecção de camundongos pela via oral. A avaliação histopatológica mostrou que o processo inflamatório na fase aguda foi mais intenso e com presença de parasitismo apenas no tecido cardíaco para a cepa YGFP. Na fase crônica a inflamação foi reduzida e não foram encontrados parasitos visíveis nos tecidos avaliados. Contudo, a PCR revelou a presença de DNA do parasito em todos os tecidos examinados. Os resultados do presente trabalho sugerem que a dinâmica da co-infecção está mais associada às características das cepas de T. cruzi do que a linhagem genética (DTU) à que elas pertencem. Parasitos transfectados expressando genes repórteres distintos pode ser uma ferramenta útil no estudo da dinâmica de infecção mista.Abstract : Acute Chagas' disease outbreaks associated with oral transmission have been reported in Brazil and other South American countries. However, oral infection dynamics studies are still incipient. The present work aimed to evaluate the in vitro and in vivo interaction of T. cruzi TcI and TcII transfected strains with plasmids pTREXRFP / GFPNeo and pROCKGFPNeo. Transfected SC25 (TcI) and SC96 (TcII) strains were showed stable RFP and GFP fluorescent proteins expression, respectively. Y strain expressing GFP was used in parasite-host interaction assays. In vitro studies showed that transfection did not afected the strains growth. Co-infection assays in THP-1 cells showed that mixtures of TcI and TcII parasites in different proportions had lower levels of infection than those observed for the isolated strains and that the same cell carries infection by the two strains of parasites. Triatomines infected with each transfected strains showed a similar infection rate. In contrast, mixed infections showed a predominance of TcII lineage parasites in the insect gut. In mice, oral infection with TcI strainwas not able to induce detectable blood parasitemia in the animals. On the other hand, the YGFP strain caused patent blood parasitemia and in mixed infections only TcII parasites were detected in blood and tissues of infected mice. Treatment of trypomastigotes of the SC25RFP strain with pepsin significantly reduced their ability to infect THP-1 cells, suggesting that passage through the gastric environment may have interfered with the parasite capacity to infect mice by oral route. The histopathological evaluation showed that inflammatory process was more intense in the acute phase and YGFP parasites were detected only in heart. In the chronic phase inflammation was reduced and no visible parasites were found in the evaluatedt issues. However, PCR revealed parasite DNA in all examined tissues. The present work suggest that co-infection dynamics is more associated with the T. cruzi strain characteristics than the genetic lineage (DTU) to which they belong. Transfected parasites expressing different reporter genes may be a useful tool for the study of mixed infection dynamic