Dinâmica microbiana nitrificante e desnitrificante em wetland construído vertical

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Florianópolis, 2017Maximizar a remoção do nitrogênio presente em esgoto sanitário submetido ao tratamento em wetlands construídos verticais descendentes (WCVD) e verticais de fundo saturado (WCVD-FS) é um parâmetro chave para o desenvolvimento desta ecotecnologia, sendo primordial o entendimento do comportamento da comunidade microbiana nitrificante e desnitrificante, vinculado aos parâmetros operacionais destas unidades. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi avaliar a dinâmica microbiana associada às transformações do nitrogênio, e sua relação com parâmetros operacionais em wetlands construídos verticais descendentes. Foram utilizados três procedimentos experimentais (PE) distintos, todos operados com esgoto sanitário. No PE I, por meio da técnica FISH, foi avaliada a interferência de períodos de alimentação e repouso de 30 dias, na comunidade bacteriana nitrificante e desnitrificante, em microcosmos que simularam o perfil vertical de WCVD (colunas DN 150 mm), e, também, em um WCVD-FS em escala real (área superficial de 3.144 m2), ambos preenchidos com areia como material filtrante. Os períodos de repouso de 30 dias promoveram um decaimento na abundância de bactérias nitrificantes. Contudo, com a retomada da alimentação, as mesmas restabeleceram-se no meio, e não afetaram a nitrificação. Por outro lado, bactérias desnitrificantes não foram influenciadas pelos períodos de repouso. No PE II, foi avaliado um WCVD em escala piloto (3 m² de área superficial) preenchido com areia e brita como material filtrante, operado sob uma taxa hidráulica (TH) de 375 mm d-1 e duas cargas orgânicas distintas: período I: com 6 meses de operação e aplicação de 130 g DQO m-2 d-1 e período II: com 3 meses de operação e aplicação de 80 g DQO m-2 d-1. Ao final de cada período, foram coletadas amostras do maciço filtrante na camada da superfície e do fundo do WCVD, e foi empregada a técnica de qPCR (em nível de DNA e RNA) para identificar a abundância e atividade de genes expressos no processo de transformação do nitrogênio, tais como, amoA de bactérias oxidantes de amônia (AOB), amoA de arqueas oxidantes de amônia (AOA) e nosZ de bactérias desnitrificantes. Além disso, com as amostras do período II, foi realizado o sequenciamento de nova geração do 16S rRNA para eubactérias e arqueas (em nível de RNA). Os resultados do PE II demonstraram que a nitrificação foi realizada por AOB (Nitrosospira), AOA (Nitrososphaeraceae) e NOB (Nitrobacter). AOB foram mais abundantes que as AOA nos dois períodos. Contudo, AOA em ambas as camadas e períodos (106 transcritos amoA g-1) apresentaram maior atividade que AOB (variando entre 105 e 106 transcritos amoA g-1). AOA mostraram ser mais estáveis e menos afetadas pelas variações operacionais. Bactérias desnitrificantes foram identificadas em maior atividade (106 transcritos nosZ g-1) na camada da superfície, quando aplicada uma carga orgânica de 130 g DQO m-2 d-1. Já quando a carga orgânica baixou para 80 g DQO m-2 d-1, maior atividade desnitrificante (106 transcritos nosZ g-1) passou a ser identificada na camada do fundo. No PE III, foi avaliado um WCVD e um WCVD-FS (ambos com 1,5 m² de área superficial, com areia e brita como material filtrante), operados em paralelo, sob as mesmas condições operacionais (40 g DQO m-2 d-1 e TH de 133 mm d-1). Após 6 meses de operação, foi coletada uma amostra do maciço filtrante na camada da superfície e do fundo nos dois wetlands, e foram realizadas as mesmas análises microbiológicas conduzidas no PE II. No WCVD a atividade de AOA (Nitrososphaeraceae e Nitrosopumilaceae) foi de 106 e 105 transcritos amoA g-1 na camada da superfície e do fundo, respectivamente, enquanto que a atividade de AOB (Nitrosomonadaceae) diminuiu (102 e 103 transcritos amoA g-1 na camada da superfície e do fundo, respectivamente). Já no WCVD-FS, um comportamento oposto ao WCVD foi identificado. A atividade de AOA (Nitrososphaeraceae) diminuiu na camada saturada três ordens de grandeza (de 107 para 104 transcritos amoA g-1) e a de AOB (Nitrosomonadaceae) nessa camada, apresentou maior estabilidade (de 105 para 104 transcritos amoA g-1). Apesar disso, AOA permaneceram sendo mais ativas que AOB em ambos os wetlands. Nos dois wetlands, a oxidação do nitrito foi conduzida pelas bactérias oxidantes de nitrito (NOB) Nitrobacter e Nitrospira. Além disso, identificou-se uma relação de simbiose entre AOA e NOB na região oxidativa dos wetlands. A atividade de bactérias desnitrificantes (105 transcritos nosZ g-1) foi claramente enriquecida na camada saturada do WCVD-FS. De forma geral, nitrificação e desnitrificação simultâneas foram identificadas em todos os PE. Alta atividade de AOA, AOB, e bactérias desnitrificantes foram identificadas ao longo do perfil vertical do WCVD operado sob uma carga orgânica de 80 g DQO m-2 d-1 e TH de 375 mm d-1, com ciclos de alimentação e repouso de 3,5 dias. Estas condições operacionais em conjunto com a saturação da camada de fundo do maciço filtrante, apresentam-se como alternativas promissoras na maximização da remoção do nitrogênio em wetlands construídos verticais.Abstract: To enhance the nitrogen removal present in urban wastewater submitted to treatment in unsaturated vertical flow constructed wetlands (UVF) and partially saturated vertical flow constructed wetlands (SVF) is a key parameter for the development of this ecotechnology. It is essential, therefore, to understand the behavior of the nitrifying and denitrifying microbial communities linked to the operational parameters of these wetlands. In this context, the aim of this study was to evaluate the microbial dynamics associated with nitrogen transformations and their relation with operational parameters in vertical subsurface flow constructed wetland. Three different experimental procedures (EP) were used and all of them were conducted using urban wastewater. In the EP I, it was evaluated the interference of feeding and rest periods of 30 days in the nitrifying and denitrifying bacteria through the use of the FISH technique, in microcosms that simulated the vertical profile of UVF (columns Ø 150 mm) and full scale SVF wetland (surface area of 3,144 m²). Both units were filled with sand as bed media. Rest periods of 30 days promoted decay in the nitrifying bacteria abundance. However, with the resumption of feeding, nitrifying bacteria reestablished in the bed media and did not affect nitrification. On the other hand, denitrifying bacteria were not influenced by the rest periods. In the EP II, it was evaluated a UVF wetland in pilot scale (surface area of 3 m²) with sand and gravel as bed media, which was operated under hydraulic loading rate (HLR) of 375 mm d-1 and two different organic loading rates (OLR): (i) period I: 6 months of operation with OLR of 130 g COD m-² d-1; and (ii) period II: 3 months of operation with OLR of 80 g COD m-² d-1. At the end of each period, samples were collected from the bed media, in the top and bottom layers of the UVF wetland. qPCR (at DNA and RNA level) was performed to identify abundance and activity of expressed gens in nitrogen transformation processes, such as amoA of ammonia oxidizing bacteria (AOB), amoA of ammonia oxidizing archaea (AOA) and nosZ of denitrifying bacteria. Moreover, with samples from period II, it was conducted the high throughput sequencing of 16S rRNA for eubacteria and archaeal (at RNA level). The results from EP II showed that nitrification was performed by AOB (Nitrosospira), AOA (Nitrososphaeraceae) e NOB (Nitrobacter). AOB were more abundant than AOA in both periods. However, AOA in both layers and periods (106 amoA trancripts g-1) presented more activity than AOB (which ranged between 105 and 106 amoA transcripts g-1). AOA showed to be more stable and less affected by the operational variations. Denitrifying bacteria were identified more active in the top layer (106 nosZ transcripts g-1) with OLR of 130 g COD m-2 d-1. When the OLR decreased for 80 g COD m-2 d-1, more denitrifying activity became identified in the bottom layer (106 nosZ trancripts g-1). In the EP III, it was evaluated a UVF and a SVF wetlands (surface area of 1.5 m² for each unit, with sand and gravel of bed media), operated in parallel, under de same conditions (OLR of 40 g COD m-2 d-1 and HLR of 133 mm d-1). After 6 months of operation, samples from the top and bottom layers of the bed media were collected from both wetlands. The same microbiology analyses performed in EP II were conducted in these samples. In the UVF wetland the AOA activity (Nitrososphaeraceae and Nitrosopumilaceae) was of 106 and 105 amoA transcripts g-1 in the top and bottom layers, respectively. While the activity of AOB (Nitrosomonadaceae) decreased (102 and 103 amoA g-1 transcripts in the top and bottom layers, respectively), the SVF wetland showed the opposite behavior. AOA (Nitrososphaeraceae) activity decreased three orders of magnitude in the bottom layer (from 107 to 104 amoA trancripts g-1), and AOB (Nitrosomonadaceae) showed more stability (from 105 to 104 amoA trasnscripts g-1). Despite this, AOA remained more active than AOB in both wetlands. Nitrite oxidation in UVF and SVF wetlands was conducted by nitrite oxidizing bacteria (NOB) such as Nitrobacter and Nitrospira. Furthermore, a symbiosis relationship between AOA and NOB was identified in the oxidative layer from both wetlands. Denitrifying bacteria activity (105 transcripts nosZ g-1) was clearly enriched at the saturated layer in the SVF wetland. In general, simultaneous nitrification and denitrification were identified in all EP. High AOA, AOB and denitrifying bacteria activity were identified along the vertical profile of the UVF wetland operated under OLR of 80 g COD m-2 d-1 and HLR of 375 mm d-1, with cycles of feeding and rest of 3.5 days. These operational conditions together with bottom layer saturation in the bed media are presented as promising alternatives in the maximization of the nitrogen removal in vertical subsurface flow constructed wetlands