Estudos in vitro da modulação do microambiente tumoral: uma relação entre inflamação, melanoma e obseidade

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016.Inúmeros estudos demonstram que a inflamação em indivíduos obesos está fortemente associada com um maior risco de desenvolvimento e progressão tumoral. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) é uma das citocinas responsáveis pela iniciação e progressão de tumores, como também a amiloide sérica A (SAA), proteína produzida pelo fígado e pelo tecido adiposo em condições de inflamação. Além disso, ligantes do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR), como o EGF, demonstraram efeitos no favorecimento da proliferação celular e metástase. Neste sentido, analisamos se o soro de pacientes obesos e meio de cultura suplementado com citocinas poderiam criar um microambiente favorável ao crescimento tumoral com células de melanoma, além de verificar alterações na expressão gênica relacionada à progressão tumoral (B-RAF e N-RAS). Realizamos o ensaio clonogênico, o ensaio de migração 2D e ciclo celular em três linhagens de melanoma, SK-mel-19, SK-mel-28 e SK-mel-147. Uma delas, a SK-mel-28, demonstrou uma resposta mais intensa em relação à migração e capacidade clonogênica quando tratada com TNF-a e EGF. Deste modo, as células com mutação em B-RAF (SK-mel-28) foram tratadas com soro de 10 pacientes com IMC acima de 30 kg/m2, e 6 indivíduos com IMC abaixo de 25kg/m2, TNF-a (25 e 50 pg/mL), EGF (100 ng/mL), IL-1ß (10 pg/mL), IL-6 (10 pg/mL), MCP-1 (25 pg/mL) e SAA (75 ng/mL) a fim de avaliar os efeitos de componentes inflamatórios na migração pelo ensaio de migração 2D, e na expressão de B-RAF e N-RAS por PCR em tempo real. Também analisamos estes tratamentos na co-cultura de SK-mel-28 e mononucleares isolados do sangue periférico (PBMC). Foi observado um aumento na capacidade migratória das células de melanoma quando tratadas com soro dos obesos, rico em SAA (soros com concentração de SAA 50 vezes maior do valor de referência), além do tratamento com TNF-a. O soro dos obesos aumentou a expressão de N-RAS nas células de melanoma, fato também observado após tratamento com IL-6. As citocinas IL-1ß e IL-6 ampliaram a expressão de B-RAF. No ensaio clonogênico, os tratamentos com EGF e TNF-a aumentaram a capacidade clonogênica. Além disso, na co-cultura de melanoma com mononucleares, as células foram capazes de liberar citocinas no sobrenadante após tratamento com proteínas inflamatórias. Os resultados demonstraram uma associação entre as citocinas envolvidas em situação de obesidade (TNF-a, EGF, IL-1ß, IL-6, MCP-1 e SAA) e progressão tumoral, e sugerem que as citocinas pró-inflamatórias podem servir como alvo secundário no tratamento do melanoma. É necessário um aperfeiçoamento no entendimento dos efeitos das citocinas nas células de melanoma a fim de desenvolver novas abordagens terapêuticas para o tratamento do câncer.Abstract : It has been shown that low-grade inflammation on obese patients is strongly associated with an increased risk of cancer development and tumor progression. Tumor necrosis factor-a (TNF-a) is one of the cytokines that are responsible for both initiation and progression of tumors, as well as serum amyloid A (SAA), a cytokine produced by both liver and adipose tissue in inflammatory conditions. In addition, epidermal growth factor receptor (EGFR) ligands, such as EGF, have also demonstrated effect on fostering cell proliferation, tumor resistance and metastasis. Therefore, we examined whether serum from obese patients and cytokine-supplemented medium could create a growth-enhancing microenvironment in melanoma cells and gene expression alterations regarding tumor progression in melanoma (B-RAF and N-RAS). We performed clonogenic assay, scratch assay and cell cycle analysis in three different melanoma cell lines. One of them (SK-mel-28) demonstrated a major improvement regarding migration and clonogenicity when treated with TNF-a and EGF. Therefore, B-RAF mutated melanoma cells (SK-mel-28) were treated with serum from 10 patients with BMI > 30 kg/m2, and 6 individuals with BMI < 25 kg/m2, TNF-a (25 and 50 pg/mL), EGF (100 ng/mL), IL-1ß (10 pg/mL), IL-6 (10 pg/mL), MCP-1 (25 pg/mL) and SAA (75 ng/mL) in order to evaluate the effect of these cytokines on 2D cell migration, along with B-RAF and N-RAS gene expression by real-time PCR. We also analyzed these treatments in co-culture of SK-mel-28 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). An improve in melanoma cell migration was observed on cells treated with SAA-rich serum of obese patients (sera with a 50-fold increment of SAA above reference value), along with TNF-a?treated cells. Likewise, SAA-rich serum increased N-RAS gene expression in melanoma cells, fact observed with treatment with IL-6 as well. Cytokines such as IL-1ß and IL-6 increased the expression of B-RAF. In clonogenic assay, treatment with EGF increased the colony-forming potential, as well as TNF-a. Furthermore, when in co-culture of melanoma with PBMC, cells were able to release cytokines in supernatant after treatment with inflammatory proteins. The results demonstrated an association between cytokines involved in obesity (TNF-a, EGF, IL-1ß, IL-6, MCP-1 and SAA) and tumor progression, moreover, these cytokines may be target for melanoma treatment. The improvement in the understanding of the effects of cytokines in tumor cells is important in order to pave the way for new therapeutic approaches for cancer treatment