Presença de anticorpos contra um peptídeo conservado do envelope do dengue vírus em soro humano

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2016A dengue é considerada um grande problema de saúde pública em regiões tropicais e subtropicais do mundo. O principal alvo de anticorpos para o vírus da dengue (DENV) é a proteína do envelope (E). Áreas da proteína E que são conservadas estruturalmente e funcionalmente podem ser alvos de anticorpos neutralizantes contra os quatro sorotipos. Dados de bioinformática da proteína E do DENV identificaram a presença de um peptídeo altamente conservado na estrutura de todos os quatro sorotipos virais, localizado no E-DII da proteína viral. O peptídeo E250-270 constitui a maior porção conservada e é exposto na conformação trimérica da proteína E. Acredita-se que anticorpos direcionados contra ele possam ser neutralizantes. O presente trabalho avaliou a presença de anticorpos anti-E250-270 em soro de pacientes infectados. Para tanto, um ELISA indireto contra E250-270 foi desenvolvido. Inicialmente foram expressas as proteínas GST e KLH fusionadas ao peptídeo e ambas foram utilizadas como antígenos de imunização para obtenção de anticorpo monoclonal contra o E250-270. Para o ELISA indireto, foram selecionadas 82 amostras, 54 positivas para dengue (DV) e 28 de doadores saudáveis. A área sob a curva (ASC) foi calculada para cada amostra através de uma leitura cinética de 30 minutos (DO 450 nm) e a curva ROC foi construída visando o critério de máxima sensibilidade e especificidade. Os grupos testados diferiram entre si em relação à média da ASC (t = - 2,9722, df = 80, p = 0,0039). O ponto de corte sugerido pela curva ROC foi de 10,386, com sensibilidade de 59,2 % e especificidade de 64 %, VPP = 74,4 % e VPN = 45,0 %. Entre as amostras positivas para DV, 34 delas ficaram acima do ponto de corte, indicando a presença de anticorpos IgG anti E250-270. Entre os doadores saudáveis, 10 amostras ficaram acima do ponto de corte, entretanto foi verificado que sete delas haviam sido vacinadas contra a febre amarela, que também é um Flavivirus. Isso pode explicar o reconhecimento de E250-270, uma vez que existem similaridades entre as sequências do peptídeo com a sequência do vírus atenuado da vacina. Dessa forma, o estudo demonstrou a presença de anticorpos contra E250-270 em amostras positivas para DV. Estudos futuros poderão correlacionar a presença desses anticorpos com gravidade ou proteção da doença. Abstract : Dengue represents a large-scale public health problem in tropical and subtropical regions of the world. The main target of antibodies against dengue virus (DENV) is the envelope protein (E). Structurally and functionally preserved regions of the E protein can be target of neutralizing antibodies against all four serotypes. Bioinformatics data on the E protein of DENV identified the presence of a highly conserved peptide in all four serotypes structure located on the E-DII of the viral protein. E250-270 peptide is the most conserved portion of the E protein and is exposed in its trimeric conformation. It is thought that antibodies directed against it might be neutralizing. Therefore, this study evaluated the presence of anti-E250-270 antibodies in serum of infected patients through an indirect ELISA. E250-270 fused to GST and KLH proteins were expressed and used as immunizing antigens to obtain monoclonal antibodies against E250-270. For indirect ELISA, we selected 82 samples, 54 positive for dengue (DV) and 28 healthy donors. The area under the curve (AUC) was calculated for each sample from kinetic readings up to 30 minutes (OD 450 nm) and a ROC curve was built using maximum sensitivity and specificity criteria. Tested groups differed among each other in comparison to AUC mean (t = - 2.9722, df = 80, p = 0.0039). The suggested cut-off point for the ROC curve was 10.386, with a sensitivity of 59.2 % and specificity of 64 %, PPV = 74.4 % and NPV = 45.0 %. Among positive samples for DV, 34 of them were above the cut-off point, indicating the presence of IgG antibodies anti- E250-270. Among healthy donors, 10 samples were above the cut-off; however, seven of them had been vaccinated against yellow fever, which is also caused by a Flavivirus and has a similar peptide sequence. Thus, the study showed the presence of antibodies against E250-270 in positive samples for DV. Future studies could correlate the presence of these antibodies with gravity or protection against the disease