Identificação e caracterização molecular e transcricional de crustinas do tipo I no camarão Litopenaeus vannamei

Dissertação (mestrado) - Univesidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são moléculas essenciais do sistema imune de diversos organismos, participando eficientemente no combate a uma ampla variedade de microrganismos patogênicos. Em camarões, quatro principais famílias de AMPs foram descritas, dentre as quais se destacam as crustinas. Essa família encontra-se distribuída em diversas espécies de crustáceos e apresenta atividades antimicrobianas e antiproteolíticas. Classicamente, as crustinas estão divididas em 5 principais grupos, referidos como Tipos I a V. No camarão Litopenaeus vannamei, apesar de terem sido reportadas crustinas dos Tipos II, III e IV, até o presente ainda não foram descritas crustinas do Tipo I. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar, em nível molecular e transcricional, crustinas do Tipo I em L. vannamei. Sequências de crustinas do Tipo I foram buscadas em bancos transcriptômicos não anotados de L. vannamei (GenBank), submetidas a reconstruções filogenéticas para confirmação de sua autenticidade e usadas no desenho de iniciadores para análises de expressão gênica. Doze sequências de L. vannamei foram resgatadas utilizando-se 41 sequências de crustinas do Tipo I de 22 espécies de crustáceos como referência. As análises filogenéticas indicaram a existência de, pelo menos, dois Subtipos de crustinas do Tipo I em L. vannamei: LvCrus Ia (10 sequências) e LvCrus Ib (2 sequências). Os dois subtipos compartilharam uma alta identidade aminoacídica (>80%) e uma estrutura condizente com as crustinas do Tipo I: um peptídeo sinal seguido de um peptídeo maduro contendo doze resíduos de cisteína, oito dos quais compondo o domínio conservado WAP (Whey Acidic Protein), característico desses AMPs. As análises moleculares mostraram um ponto isoelétrico teórico de 5,01-5,64 para LvCrus Ia (massa molecular de 9,6 kDa) e 7,66 para LvCrus Ib (massa molecular de 11,5 kDa). A expressão de crustinas do Tipo I mostrou um perfil similar de expressão em diferentes tecidos dos animais após um estímulo bacteriano. Interessantemente, LvCrus Ia e LvCrus Ib mostraram-se altamente expressos nas brânquias de animais estimulados e não estimulados, mas não nos hemócitos que são as células imuncompetentes de camarões. Para fins comparativos, a distribuição das demais crustinas de L. vannamei também foi investigada. As crustinas do Tipo II (IIa e IIb) mostraram uma distribuição idêntica, estando presentes em hemócitos e brânquias e as crustinas dos Tipos III e IV foram unicamente hemocitárias. Os níveis transcricionais deLvCrus Ia foi analisado no intestino médio de animais 48 horas após uma infecção experimental por dois patógenos de camarões: o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) ou a bactéria Vibrio harveyi. A expressão de LvCrus Ia apresentou um aumento superior a 50 vezes em animais inoculados com água do mar estéril e com a bactéria V. harveyi, mas não houve diferença entre esses dois tratamentos. Analogamente, não houve modulação na expressão de LvCrus Ia após o desafio viral. Nos hemócitos, apenas as crustinas do Tipo IV (LvSLPI) foram induzidas após a infecção bacteriana. As crustinas do Tipo I de camarões peneídeos compõem, portanto, um grupo diverso de AMPs tanto em termos de estrutura primária, características bioquímicas e no perfil de expressão gênica. Ademais, este trabalho representa o primeiro relato de crustinas aniônicas e de um grupo de AMPs não hemocitários em L. vannamei.Abstract : Antimicrobial peptides (AMPs) are essential molecules of the immune system of different organisms, participating effectively in the combat to a wide range of pathogenic microorganisms. In shrimp, four main AMP families were described, including the crustins. This AMP family is largely distributed among crustaceans and displays both antimicrobial and antiproteolytic activities. Crustins are classically divided in 5 groups, referred as Types I to V. In L. vannamei shrimp, despite the report of crustins from Types II, III and IV, Type I crustins were not still identified in this species. In this context, the aim of the present study was to identify and characterize at molecular and transcriptional levels Type I crustins in L. vannamei. Sequences coding for Type I crustins were searched in non-annotated transcriptomic libraries from L. vannamei (available in GenBank), submitted to phylogenetic reconstructions for the confirmation of their authenticity and then used for the design of specific primers for gene expression analyses. Twelve sequences were identified in L. vannamei libraries by using as query 41 Type I crustin sequences from 22 crustaceans. Phylogenetic analysis indicated the presence, at least, of two Subtypes of Type I crustins in L. vannamei: LvCrus Ia (10 sequences from nerve cord libraries) e LvCrus Ib (2 sequences from hemocyte libraries). The two Subtypes shared a high amino acid identity (>80%) and a primary structure consistent with other Type I crustins: a leader sequence followed by a mature peptide containing twelve cysteine residues, eight of them comprising a conserved WAP (Whey Acidic Protein) domain, typical of this AMP family. Molecular analysis showed a theoretical isoelectric point of 5.01-5.64 for LvCrus Ia (molecular weight = 9.6 kDa) and 7.66 for LvCrus Ib (molecular weight = 11.5 kDa). The gene expression of both Type I crustins showed to be similar in the different tissues of bacterial-challenged shrimp. Interestingly, LvCrus Ia and LvCrus Ib showed to be highly expressed in gills of both stimulated and non-stimulated animals, but not in hemocytes that are the shrimp immunocompetent cells. For comparative purposes, the gene expression distribution of other L. vannamei crustins was also evaluated. The gene expression distribution of Type II crustins (IIa and IIb) were identical, which were detected in hemocytes and gills, whereas the expression of crustins from Types III and IV showed to be restrict to hemocytes. The transcriptional levels of LvCrus Ia were analyzed in the midgut at 48 hours after an experimental infection with two shrimp pathogens: the White Spot Syndrome Virus(WSSV) or the Gram-negative Vibrio harveyi. The expression of LvCrus Ia increased more than 50-fold in seawater-injected shrimp and animals infected with V. harveyi, but no differences were observed between treatments. Besides, no differences in gene expression modulation were observed for LvCrus Ia in response to the viral infection. In hemocytes, only the expression of Type IV crustins (LvSLPI) was induced in response to the bacterial infection. Type I crustins from penaeid shrimp comprise a diverse group of AMPs in terms of primary structure, biochemical features and gene expression profile. Additionally, the present study represents the first report of anionic crustins and the first identification of non-hemocytic AMPs in L. vannamei