Perfil de compostos fenólicos e efeito antitumoral in vivo e in vitro de extratos da casca de noz pecã [Carya illinoinensis (Wangenh) C. Koch]

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2017.A casca de noz pecã é utilizada pela população do sul do Brasil para o preparo de chás com alegação de propriedades benéficas à saúde, como o efeito protetor e curativo contra diabetes, obesidade e distúrbios do metabolismo lipídico. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar extratos da casca de noz pecã [Carya illinoinensis (Wangenh.) C. Koch] obtidos por extração assistida por ultrassom e avaliar seus efeitos antitumorais in vitro e in vivo. As maiores concentrações de compostos fenólicos no extrato aquoso foram obtidas sob as condições de extração de 60 °C, razão sólido: solvente de 30 mL/g e tempo de extração igual a 35 minutos. No extrato hidroalcóolico as maiores concentrações de compostos fenólicos foram obtias com temperatura de extração igual a 80 °C, razão sólido: solvente de 30 mL/g, concentração de etanol de 20 % v/v e tempo de extração de 25 minutos. Sob essas condições obteve- se concentração de compostos fenólicos totais de 426 e 582 mg GAE/g de extrato, taninos condensados de aproximadamente 77 e 71 mg CE/g, atividade antioxidante pelo método ABTS de 2574.32 e 2573.0 µmol TEAC/g, e pelo método DPPH 1268.0 e 1287.0 µmol TEAC/g para os extratos aquoso e hidroalcóolico, respectivamente. No extrato aquoso foram identificados por LC-ESI-MS/MS, 29 compostos fenólicose no extrato hidroalcóolico 27 compostos, sendo catequina e ácido gálico os compostos majoritários em ambos os extratos Dos compostos identificados, 24 foramobservados pela primeira vez neste material. Foram realizados ensaios para avaliação do efeito antitumoral in vitro (culturas de células de câncer da mama humana - MCF-7) e in vivo (camundongos Balb-C inoculados com tumor ascítico de Ehrlich). O extrato aquoso apresentou citotoxicidade com concentração inibitória de 50 % (IC50) em torno de 74 µg/mL de extrato. Doses de 15, 20 e 25 µg/mL do extrato mostraram efeito antiproliferativo, com redução de até 93 % no número total de colônias. O tratamento das células com o extrato aquoso promoveu a morte por apoptose culminando em grande número de células na fase G0/Sub G1 e redução do número de células na fase G1 e G2/M. Ensaios moleculares demostraram que os compostos do extrato da casca de noz pecã foram capazes de intercalar e danificar as bases do DNA. O extrato aquoso da casca de noz pecã promoveu inibição no crescimento tumoral em camundongos Balb/C inoculados com tumor ascítico de Ehrlich em torno de 52 %, aumentando a sobrevida dos animais tratados em 67 % (p<0,05). Estes efeitos foram associados ao aumento da morte celular por apoptose (55 %) com consequente modulação das proteínas Bax, p53 e BcL-xL, envolvidas na regulação da morte celular. Nos ensaios in vivo o extrato também foi capaz de parar o ciclo celular na fase G1, diminuindo a expressão das proteínas ciclina A, ciclina B e CDK2 responsáveis pela regulação do ciclo celular. Nessa fase observou-se ainda que o extrato foi capaz de aumentar a expressão da proteína ?H2AX, indicando fragmentação do DNA das células do tumor ascítico de Ehrlich. Os ensaios para indicação da prevenção de tumores mediada pelo extrato aumentaram a sobrevida em até 68 %, diminuindo o desenvolvimento do tumor em até 46 % (p<0,05). Foi observado que houve aumento do número de células em apoptose em todos os grupos tratados, bem como da expressão das proteínas pró-apoptóticas Bax e p53. Dano ao DNA das células tumorais também foi evidenciado pelo ensaio cometa e aumento da expressão da proteína ?H2AX. Foi observada uma redução nos níveis de peroxidação lipídica pelo ensaio TBARS, aumento da glutationa reduzida (GSH), além da modulação das enzimas envolvidas na regulação do sistema antioxidante endógeno. Os resultados obtidos indicaram que os extratos da casca de noz pecã são ricos em compostos bioativos, apresentando efeito antitumoral nos modelos avaliados.Abstract : Pecan nut shell is used by the south Brazilian population to prepare teas, that use the drink claiming health properties, such as the protective and curative effect against diabetes, obesity, lipid metabolism disorders. The aim of this study was to characterize pecan nut shell extracts [Carya illinoinensis (Wangenh.) C. Koch] obtained by ultrasound-assisted extraction and evaluate their antitumor effects in vitro and in vivo. The highest concentrations of phenolic compounds in the aqueous extract were obtained under the extraction conditions of 60 ° C, solid:solvent ratio of 30 mL/g and extraction time equal to 35 minutes. The hydroalcoholic extract obtained higher concentrations of phenolic compounds using extraction temperature of 80 °C, solid:solvent ratio of 30 mL/g, ethanol concentration of 20 % v/v and 25 minutes for extraction time. Under these conditions it was obtained concentration of total phenolic compounds of 426 and 582 mg GAE/g, condensed tannins of approximately 77 and 71 mg CE/g, antioxidant activity by ABTS assay of 2574.32 and 2573.0 µmol TEAC/g, and 1268.0 and 1287.0 µmol TEAC/g on DPPH assay for aqueous and hydroalcoholic extracts, respectively. In the aqueous extract samples, the LC-ESI-MS/MS analysis identified 29 phenolic compounds, while in the hydroalcoholic extract the presence of 27 compounds was identified. Of the phenolic compounds identified, 24 of them were observed for the first time in this raw material. Antitumor effect in vitro (cancer cell cultures of human breast - MCF-7) and in vivo (BALB-C mice inoculated with Ehrlich ascites tumor (n=32)) tests were performed. The results show that the aqueous extract showed cytotoxicity with an inhibitory concentration 50 % (IC50) of the cells using 74 µg of extract. Doses of 15, 20 and 25 µg/mL of the extract also showed anti-proliferative effect on MCF-7 cells with up to 93 % reduction in total cell number. Treatment of the cells with the aqueous extract promoted cell death by apoptosis culminating in cell cycle arrest in G0/SubG1 and decreased in the number of cells in G1 and G2/M phase. Molecular assays showed that the compounds of pecan nut shell extract were able to interlate and damage the DNA bases. The pecan nut shell extract promoted an inhibition in tumor growth in mice BALB / C inoculated with Ehrlich ascites tumor around 52 %, increasing the survival of treated animals by 67 % (p<0.05). These effects were associated with increased apoptotic cell death (55 %) with consequent modulation of the Bax, p53 and Bcl- xL, proteins involved in the regulation of cell death. In in vivo assays, extract was also capable of arrest the cell cycle at the G1 phase by decreasing the expression of the protein cyclin A, cyclin B, CDK2 responsible for the regulation of the cell cycle. It was observed that the extract was able to increase expression of ?H2AX protein, indicating DNA fragmentation of Ehrlich ascites tumor cells. Assays for preventing tumor development, made with Balb-C mice previously treated with the extracts before they have the Ehrlich ascites tumor inoculated, showed survival increased up to 68 %, and decreased on tumor growth by up to 46 % (p