Avaliação da ativação de componentes da via de resposta a proteínas não dobradas (UPR) na infecção pelo Zika virus

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No. of bitstreams: 1 Angela Vieira Serufo - TESE FINAL - biblioteca.pdf: 4746161 bytes, checksum: 1316b2ef61ac3eba81e5d4be7349e6d5 (MD5) Previous issue date: 2019-06-17CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorOutra AgênciaRESUMO O Zika vírus (ZIKV), do gênero Flavivirus, é o agente causador de uma doença infecciosa emergente em muitos países, com elevado número de casos reportados nos últimos anos e forte associação causal com síndromes neurológicas graves. O entendimento sobre o comportamento do vírus no organismo é de suma importância para o desenvolvimento de mecanismos de contenção da doença, para a condução de um tratamento adequado e instauração de medidas preventivas. Os vírus evoluíram numerosas estratégias para manipular as respostas do hospedeiro e garantir o seu sucesso replicativo. Durante a replicação viral ocorre elevada produção e modificações pós traducionais de proteínas virais no retículo endoplasmático (RE) das células hospedeiras, o que resulta na sobrecarga do sistema de processamento de proteínas da organela e, consequentemente, ativa uma via de resposta a proteínas não dobradas (UPR). Essa resposta é coordenada pelos sensores IRE1, PERK e ATF6 acoplados à membrana do RE que são responsáveis por monitorar a transcrição de genes e a tradução de proteínas envolvidas no controle da UPR. Este trabalho aborda o efeito da infecção por ZIKV sobre a ativação de componentes da via UPR em células de glioblastomas neuronais humanas T98G. A infecção dessas células por ZIKV mostrou regulação negativa de ATF6, em ensaios de microcoscopia de fluorescência e microscopia confocal, bem como a não ativação da atividade transcricional de ATF6 em ensaio de gene repórter da luciferase. Ainda, a expressão de genes ativados por ATF6, XBP1 e CHOP, não tiveram elevação durante a infecção pelo ZIKV. O sensor IRE1 avaliado em ensaio que monitorou o processamento do seu substrato, o mRNA do fator de transcrição XBP1, mostrou modulação dependente do tempo de infecção, com regulação negativa até 48 horas após a infecção. A expressão de genes ativados por XBP1, como EDEM1, foi ativada em 72 horas após a infecção, o que sugere ativação tardia deste sensor. A infecção por ZIKV induziu menor expressão de genes da via PERK, como ATF4, CHOP e GADD34, em estágios iniciais da infecção, ou seja, a ativação da expressão destes genes ocorreu após 72 horas para ZIKV asiática. Já ensaio com amostra africana de ZIKV induziu expressão de CHOP mais precoce, em 48 após a infecção. A expressão de 84 genes da via de UPR em infecção com ZIKV asiática, em ensaio de matriz de PCR quantitativo em tempo real, no geral, aumentou de forma expressiva em fases mais tardias da infecção. A avaliação da produção das chaperonas BIP e calregulina foi elevada somente na infecção por ZIKV africana. Nossos achados mostraram que o ZIKV é capaz de modular de forma distinta os componentes da via UPR, regulando negativamente ATF6, até estágios tardios e IRE1 e PERK apenas em estágios iniciais da infecção, com ativação da via de reposta ao estresse do RE com maior intensidade na fase mais tardia da infecção.ABSTRACT Zika virus (ZIKV), of the genus Flavivirus, is the causative agent of an emerging infectious disease in many countries, with a high number of cases reported in recent years and a strong causal association with severe neurological syndromes. Understanding the behavior of the virus in the body is of paramount importance for the development of mechanisms to contain the disease, to conduct appropriate treatment and to introduce preventive measures. Viruses have evolved numerous strategies to manipulate host responses and ensure their replicative success. During viral replication there occurs high production and post-translational modifications of viral proteins in the endoplasmic reticulum (ER) of the host cells, which results in the overload of the organelle protein processing system and, consequently, activates an unfolded protein response pathway (UPR). This response is coordinated by the IRE1, PERK and ATF6 sensors coupled to the ER membrane which are responsible for monitoring gene transcription and translation of proteins involved in UPR control. This work addresses the effect of ZIKV infection on the activation of UPR pathway components in T98G human neuronal glioblastomas cells. The infection of these cells by ZIKV showed negative regulation of ATF6 in fluorescence microscopy and confocal microscopy assays, as well as the nonactivation of the transcriptional activity of ATF6 in a luciferase reporter gene assay. Furthermore, the expression of ATF6, XBP1, and CHOP-activated genes did not show elevation during ZIKV infection. The IRE1 sensor evaluated in the assay that monitored the processing of its substrate, the transcription factor mRNA XBP1, showed time-dependent modulation of infection, with down-regulation up to 48 hours post-infection. Expression of XBP1-activated genes, such as EDEM1, was activated within 72 hours of infection, suggesting late activation of this sensor. ZIKV infection induced lower gene expression of the PERK pathway, such as ATF4, CHOP, and GADD34, in the early stages of infection, ie activation of the expression of these genes occurred after 72 hours for Asian ZIKV. Already, an African sample of ZIKV assay induced earlier CHOP expression at 48 post-infection. Expression of 84 UPR pathway genes in infection with Asian ZIKV in a quantitative real-time PCR matrix assay generally increased significantly in later stages of infection. Evaluation of the production of BIP and calregulin chaperones was high only in infection with African ZIKV. Our findings showed that the ZIKV is capable of modulating UPR pathway components negatively, regulating ATF6 to late stages and IRE1 and PERK only in the early stages of infection, with the activation of the ER response pathway with greater intensity in the later phase of infection