Células tronco mesenquimais autólogas infundidas por perfusão regional venosa na terapia da laminite crônica em equinos

A laminite destaca-se dentre as afecções em membros locomotores como principal causa de afastamento de cavalos de suas atividades. Uma possibilidade terapêutica pouco estudada é a utilização de células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (adCTM) infundidas por perfusão regional. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos terapêuticos no uso de adCTM autólogas infundidas por meio de perfusão regional da veia digital palmar e compará-los com a infusão de placebo no membro torácico contralateral de equinos em estágio inicial de laminite crônica. A metodologia experimental foi aprovada pelo Comitê de Ética (CEUA/UFMG 282/2016). Foram utilizados seis equinos, Mangalarga Marchador, fêmeas, com peso entre 381± 11 kg, com idade média de 8,3± 4,7 anos, escore corporal 6±1 (escore 1 a 9), atendidos no EV-UFMG, e identificados como portadores de laminite crônica por meio do histórico, confirmados por exame físico e radiográfico, sendo todos classificados com grau 1 a 2 de claudicação Obel. O estudo envolveu a avaliação em dois períodos equivalentes de 30 dias, antes do tratamento e após tratamento. Cada equino recebeu em ambos os membros torácicos três tratamentos com adCTM [2 x 107 células/ suspendida em 3 ml de PBS e completadas até o volume de 20 ml com solução fisiológica NaCl 0,9% (SF) – grupo adCTM], ou placebo (SF – grupo placebo) no mesmo volume infundido por perfusão regional da veia digital lateral por 30 minutos, repetidos a cada 15 dias. Para verificar a perfusão sanguínea do casco, venografias digitais foram realizadas em ambos os membros torácicos. Cada projeção foi avaliada para o nível de preenchimento vascular em locais prédeterminados, pré e pós-tratamento. Como método de avaliação da taxa de crescimento do estojo córneo, foi utilizado o implante de esferas metálicas na muralha do casco, acompanhado por exames radiográficos. Para monitoração do crescimento antes da aplicação de qualquer tratamento, foram realizados dois exames radiográficos com trinta dias de intervalo (A1 e A30). Para se verificar o efeito pleno das adCTM foram considerados dois momentos também com trinta dias de intervalo, um quinze dias após a terceira aplicação de adCTM (D30) e outro trinta dias antes deste momento final (D1). A avaliação da relação espacial entre falange distal e o estojo córneo foi obtida por programa computacional. As amostras de biópsia lamelar foram coradas com hematoxilina-eosina e ácido periódico de Schiff, e foram classificadas quanto ao grau de lesão histológico, histomorfometria epidermal lamelar e testadas para um protocolo imunohistoquímico para p63 e analisadas por microscopia pré e pós-tratamento. Considerando a soma dos escores venográficos, houve uma melhora significativa no grupo adCTM 15 dias após a terceira aplicação quando comparado ao exame pré-tratamento (P < 0,03). Essa diferença também se manifestou especificamente nas variáveis perfusão de vasos dorsais lamelares (VDL, P < 0,03) e junção circunflexa-lamelar (JCL, P< 0,03). O grupo adCTM demonstrou maior distância entre a borda coronária e o ponto de inserção das esferas ao final dos tratamentos (D30) comparado ao grupo placebo (P< 0,03). Sobre a relação espacial entre a falange distal e o estojo córneo, efeitos positivos também foram verificados nos membros tratados com adCTM, promovendo maio estabilidade da falange distal comparado ao grupo placebo. Os resultados das análises do grau de lesão histológica global em tecido lamelar pré e pós-tratamento demonstraram piora no escore global do grupo placebo (P = 0,01), com destaque para perda do eixo queratinizado (P = 0,0001), hiperplasia do estrato médio (P = 0,001), homogeneidade das lamelas epidérmicas primárias (P = 0,003) e hiperqueratose (P = 0,05), enquanto o grupo adCTM não houve piora no escore global, havendo apenas um aumento para hiperplasia do estrato médio (P = 0,05). Houve diferença entre grupos no escore global pós-tratamento (P ≤ 0,05), com destaque para a variável ausência de eixo queratinizado (P ≤ 0,01). Os achados deste estudo demonstraram que o protocolo de três aplicações intravenosas de 2 x107 por perfusão regional no dígito de equinos com laminite crônica estável promove melhorias na perfusão vascular, na taxa de crescimento do casco, na relação espacial entre casco/falange distal, no processo cicatricial lamelar apenas no casco tratado com adCTM, não verificando o mesmo efeito benéfico no grupo placebo.Laminitis stands out among the affections in locomotive limbs as the main cause of the removal of horses from their activities. A little studied therapeutic possibility are the mesenchymal stem cells. The objectives of this study were to evaluate blood perfusion, hoof growth rate and spatial relationship between the hoof capsule and the distal phalanx of horses with chronic laminitis and who were treated with adCTM infused by regional perfusion in the digital vein in the thoracic limb comparing with the contralateral limb infused with placebo solution, describe the histopathological findings of horses with chronic laminitis and classify the degree of injury pre- and post-treatment with adCTM or placebo; to evaluate epidermal lamellar histomorphometry before and after treatment with adCTM or placebo; to test the immunohistochemical protocol for the p63 antibody (progenitor epithelial cells) in lamellar samples of healthy horses with chronic laminitis. Additionally, a possible systemic effect of adCTM was observed comparing the results obtained from the infused member with those of the contralateral limb (placebo). The experimental methodology was approved by the Ethics Committee (CEUA / UFMG 282/2016). Six equines, Mangalarga Marchador, females, weighing between 381 ± 11 kg, with mean age of 8.3 ± 4.7 years, body score 6 ± 1 (score 1 to 9), attended at HV-UFMG, and identified as having chronic laminitis through history, confirmed by physical and radiographic examination, all of them being classified as grade 1 to 2 of claudication Obel. The study involved the evaluation in two equivalent periods of 30 days, before treatment and after treatment. Each horse received three treatments with adCTM [2 x 107 cells / suspended in 3 ml of PBS and completed to the volume of 20 ml with 0.9% NaCl (SF) - adCTM group] or placebo (SF - placebo group) in the same volume infused by regional perfusion of lateral digital vein for 30 minutes, repeated every 15 days. To verify the blood perfusion of the hoof, digital venographs were performed on both thoracic limbs. Each projection was evaluated for the vascular filling level at pre-determined, pre and posttreatment sites. As a method of evaluating the growth rate of the hoof capsule, the metal spheres were implanted in the wall of the hoof, accompanied by radiographic examinations. For growth monitoring before the application of any treatment, two radiographic exams were performed with a thirty-day interval (A1 and A30). In order to verify the full effect of the adCTM, two moments were also considered with a thirty-day interval, one fifteen days after the third application of adCTM (D30) and another thirty days before this final moment (D1). The evaluation of the spatial relationship between the distal phalanx and the hoof capsule was obtained by computer program. Samples of lamellar biopsy were stained with hematoxylin-eosin and periodic acid from Schiff, and were classified according to degree of histological lesion, epidermal lamellar histomorphometry and tested for an immunohistochemical protocol for p63 and analyzed by pre and post-treatment microscopy. Considering the sum of the venography scores, there was a significant improvement in the adCTM group 15 days after the third application when compared to the pretreatment test (P <0.03). This difference was also manifested specifically in the variables perfusion of lamellar dorsal vessels (LDV, P <0.03) and circumflex-lamellar junction (CLJ, P <0.03). The adCTM group showed a greater distance between the coronary border and the insertion point of the beads at the end of treatments (D30) compared to the placebo group (P