Transcriptional regulation of Toll-like receptor-inducible Rasgef1b gene

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas GeraisCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorINCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio)O fator de troca de nucleotídeos guanina RasGEF1b é codificado por um gene de expressão induzida em células do sistema imune inato em resposta à ativação de receptores do tipo Toll (TLRs). O acúmulo de seu mRNA ocorre em macrófagos humanos e murinos estimulados com diferentes agonistas de TLRs, assim como em camundongos infectados com protozoários parasitas, sugerindo que a proteína codificada desempenha uma função na resposta imune. No entanto, seu papel nesse contexto ainda não é totalmente compreendido. Além disso, os mecanismos transcricionais que regulam sua expressão são também desconhecidos, dada a ausência de estudos sobre o promotor e os potenciais elementos regulatórios envolvidos nesse processo. Uma vez que as diversas funções biológicas mediadas pelo módulo RasGEF–RasGTPase são, em parte, dependentes dos seus padrões de expressão em tipos celulares ou tecidos específicos, a compreensão dos mecanismos transcricionais que determinam sua expressão dirigida pode fornecer informações importantes a respeito de seu papel na célula. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar a região promotora que regula a expressão do gene Rasgef1b em resposta à ativação de TLRs. Para isso, clonamos uma sequência de 2.8 kb (-2747/+119) a montante da região codificadora de Rasgef1b no plasmídeo repórter da luciferase pGL3-basic. Mutantes por deleções progressivas foram gerados e a atividade de cada construção foi avaliada através de estudos de transfecção transiente e ensaio de gene repórter. Nossos resultados mostram que uma curta sequência proximal contendo 302 pb (-183/+119) é suficiente e necessária para promover eficientemente a expressão da luciferase em células HEK293 e macrófagos Raw264.7, exibindo uma atividade basal robusta, mas também induzida por TLRs. Dessa forma, fornecemos evidências diretas que essa região é responsável pela atividade do promotor de Rasgef1b. Interessantemente, identificamos que a sequência é evolutivamente conservada, está contida em uma região de cromatina acessível, contém ilha CpG, parece recrutar constitutivamente a RNA Polimerase II, e abriga essencialemente elementos de ligação a Sp1 e ao principal fator de transcrição ativado por TLRs, o NF-kB. Mostramos que a superexpressão das subunidades de NF-kB RelA ou cRel, mas não os complexos de RelB, induzem a um aumento significativo na atividade do promotor, e que mutações nos sítios kB localizados a montante ou a jusante do TSS resultam em significativa redução de sua atividade induzida por LPS em macrófagos murinos. Além disso, demonstramos através de ensaios de mobilidade eletroforética (EMSA) que parte dos elementos kB são capazes de recrutar dímeros NF-kB, e através de ChIP-seq, observamos que RelA é recrutado não somente à região do promotor, mas também a regiões distais. Finalmente, encontramos que a expressão de Rasgef1b induzida por TLRs é reduzida em macrófagos desprovidos de RelA ou tratados com o inibidor farmacológico Bay11-7082 indicando que sua expressão é parcialmente dependente de NF-kB. Em conjunto, reportamos pela primeira vez a identificação e caracterização funcional do promotor Rasgef1b, e demonstramos a contribuição do NF-kB em sua expressão induzida por TLRs.The guanine-nucleotide exchange factor RasGEF1b is encoded by a gene whose expression is induced in innate immune cells in response to the activation of Toll-like receptors (TLRs). Its mRNA accumulates in human and mouse macrophages upon stimulation with various TLRs agonists as well as in mice infected with protozoan parasites, suggesting that Rasgef1b plays a role in innate immunity. However, its role in this context is not yet fully understood. In addition, the transcriptional mechanisms that regulate its expression are still unknown due to the lack of studies about the promoter and the potential regulatory elements involved in this process. As the diverse biological functions mediated by the RasGEF/RasGTPases modules are in part dependent on their expression profile in specific cell types or tissues, understanding the transcriptional mechanisms that drive their directed expression can provide important information about their role in the cell. Therefore, our objective here was to characterize the promoter region that regulates the TLR-inducible Rasgef1b expression. For this, we cloned a 2.8 kb sequence (-2747/+119) upstream from Rasgef1b coding region in the luciferase reporter plasmid pGL3-basic. Progressive 5’ and 3’ deletions were performed and the activity of each construct was assessed by transient transfection and reporter gene assay. Our results show that a short proximal sequence containing 302 bp (-183/+119) is sufficient and necessary to efficiently promote luciferase expression in HEK293 cells and Raw264.7 macrophages, exhibiting robust basal and TLR-induced activity. Therefore, we provide direct evidence that this region harbors Rasgef1b active promoter. Interestingly, we have identified that the sequence is evolutionarily conserved, contained in an accessible chromatin region with a CpG island, appears to constitutively recruit the RNA Polymerase II, and harbors essentially Sp1 and TLR-inducible NF-kB binding sites. We showed that the overexpression of NF-κB RelA or cRel subunits, but not of RelB complexes, induced a significant increase in promoter activity, and that mutation of the kB sites located upstream or downstream from Rasgef1b TSS resulted in a significant reduction in the LPS-inducible promoter activation in mouse macrophages. In addition, we showed through electrophoretic mobility shift assays (EMSA) that some of the kB elements can recruit NF-kB dimers, and through ChIP-seq, we showed that RelA is recruited not only to Rasgef1b promoter, but also to additional distal regions. Finally, we found that the TLR-inducible Rasgef1b expression is reduced in RelA deficient or Bay11-7082-treated macrophages, indicating that its expression is partially dependent on NF-κB. Altogether, we report for the first time the identification and functional characterization of Rasgef1b promoter, demonstrating the contribution of NF-κB in its TLR-inducible expression