Caracterização de lipopeptídeos antimicrobianos e surfactantes produzidos por Bacillus spp. isolados de puba

Alimentos naturalmente fermentados como a puba constituem uma fonte de micro-organismos produtores de compostos antimicrobianos. Diversos produtos de interesse industrial são produzidos por bactérias do gênero Bacillus e incluem enzimas, antibióticos, aminoácidos,inseticidas, biossurfactantes e bacteriocinas. Neste estudo, caracterizaram-se lipopeptídeos com ação antimicrobiana e biossurfactantes produzidos pelas linhagens Bacillus spp. C3 e P5, isoladas da matriz alimentar de Puba, tendo sido escolhido um micro-organismos destes, conforme maior atividade antimicrobiana, para o prosseguimento dos experimentos. A identificação das duas bactérias foi realizada por testes fenotípicos, quimiotaxonômicos e genotípicos indicando que pertencem ao gênero Bacillus e Bacillus spp. C3 à espécie B. cereus/B. thuringiensis e Bacillus sp. P5 à espécieBacillus subtilis/amyloliquefaciens. O espectro de atividade antimicrobiana foi realizado para ambas as linhagens de Bacillus spp. Para os testes de atividade antimicrobiana de Bacillus spp. P5 utilizaram-se micro-organismos (45) que incluiram bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos filamentosos e uma levedura, em que foi observada atividade antimicrobiana frente à62% (28) dos micro-organismos testados, enquanto que Bacillus spp. C3apresentou apenas 15% de atividade antimicrobiana contra as espécies para que foi testado. Um aumento da atividade antimicrobiana foi detectadoquando Bacillus spp. P5 foi cultivado juntamente com células inativadas de outros micro-organismos mas não quando em contato com o sobrenadante destes, com maiores atividades para Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, Lactobacillus brevis E4-248, Lactobacillus fermentum E4-249 e Lactobacillus plantarum EPF-257. Estes resultados indicam que há interferência de fatores de indução - quorum sensing, especialmente quando os micro-organismos são provenientes da microbiota natural deste alimento fermentado, aumentando a produção da(s) substância(s) antimicrobiana(s) produzida por Bacillus spp. P5. O sobrenadante bruto de Bacillus sp. P5 apresentou ação bacteriostática contra Bacillus cereus ATCC 14579 e contra Listeria monocytogenes ATCC 6477. A caracterização da atividade biossurfactante foi detectada pela zona de beta hemólise ao redor da colônia, pelos testes de atividade emulsificante e pela medição da tensão superficial. Foi obervada atividade emulsificante do sobrenadante para todos os agentes hidrofóbicos testados (4), com 30 exceção do xileno, sendo este capaz de formar emulsão apenas quando testado o sobrenadante em meio Landy acrescido de glutamato.Também foi observada redução da tensão superficial do meio de cultura, sugerindo a produção de compostos tensoativos pela linhagem de Bacillus spp. P5. A técnica de PCR seguida de sequenciamento dos amplicons permitiu identificar genes relacionados à síntese das bacteriocinas subtilosina A e subtilina para Bacillus sp. C3, constituindo o primeiro registro da presença destes genes para a espécie Bacillus thuringiensis/B. cereus, a qual posssivelmente pertence Bacillus sp. C3 e de subtilosina A e dos lipopetídeos iturina A e surfactina para Bacillus sp. P5. Dentre as técnicas de purificação empregadas neste trabalho as que apresentaram melhores resultados foram a extração como butanol, seguidas por cromatografia de fase reversa em coluna C18 acoplada ao HPLC e espectrometria de massas MALDI-TOF para a pesquisa no sobrenadante da cultura. Para a pesquisa das substâncias diretamente na matriz alimentar substituiu-se a cromatografia de fase reversa através de coluna C18 e adaptou-se o método de extração com butanol com a utilização de coluna C4 (zip tip). O isolado Bacillus sp. P5 é capaz de co-produzir cinco (5) diferentes tipos de lipopeptídeos (surfactina, fengicina, iturina, micosubtilina e bacilomicina) e, portanto, apresenta diferentes atividade de biocontrole. Além disso, este trabalho demonstrou a elevada produção de diferentes isoformas de surfactina (de C13- C17), em meio de cultura, incluindo a isoforma C15, biologicamente a mais ativa e a isoforma C17, raramente descrita, bem como a detecção inédita de lipopeptídeos como fengicina e iturina diretamente na matriz alimentar de puba de mandioca. Este alimento é amplamente consumido por populações no norte e nordeste do Brasil e o conhecimento acerca destas substâncias poderia contribuir para o aumento da segurança alimentar e da vida de prateleira deste tipo de alimento.Naturally fermented foods like cassava puba are sources of microorganisms able to produce antimicrobial compounds. Several products of industrial interest are produced by Bacillus whichinclude enzymes, antibiotics, aminoacids, insecticides, biosurfactants and bacteriocins. In this study biosurfactants and antimicrobial substances produced by Bacillus spp. (5 C3 and P5) isolatedfrom the food matrix Puba were characterized, and the one with higher antimicrobial activity was chosen for further testing. The identification of both bacteria was performed by phenotypic, chemotaxonomic and genotypic tests, and the resultsindicated that they belong to the genusBacillus and Bacillus sp. C3 to B. cereus/B. thuringiensis and Bacillus sp. P5 to the species Bacillussubtilis/amyloliquefaciens. The spectrum of antimicrobial activity was assessed using microorganisms (45) which included Gram-positive and Gram-negative bacteria, filamentousfungi and yeasts, and activity against 62% (28) of the test organisms was observed. An increase in antimicrobial activity was detected when Bacillus sp. P5 was cultured with inactivated cells of other microorganisms, but not when in contact with the supernatant of these, with higher activities for Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, Lactobacillus brevis E4-248, Lactobacillus fermentumE4-249 and Lactobacillus plantarum EPF-257. These results indicate that there isinterference of quorum-sensing inducing factors, especially when the microorganisms were from the natural microbiota of this fermented food, increasing the production of the antimicrobialsubstance(s) by Bacillus sp. P5. The crude supernatant of Bacillus sp. P5 showe bacteriostatic action against Bacilluscereus ATCC 14579 and against Listeria monocytogenes ATCC 6477. The characterization of biosurfactant activity was detected by beta hemolysis zone around the colony, by emulsifying activity tests and the measurement of the surface tension. Emulsifying activity of the supernatant was observed for all the tested substances (4), with the exception of xylene, which is capable of forming emulsion only when tested in the supernatant medium Landy with glutamate. Reduction of the surface tension of the culture medium was also observed, suggesting the production of surface-active compounds by the bacteria. The PCR followed by sequencing of amplicons allowed the identification of genes related to the synthesis of the bacteriocins subtilosin A and subtilin for Bacillus sp. C3 constituting the first record of the presence of these genes for Bacillus thuringiensis/B. cereus species, which possibly belongs toBacillus sp. C3. Regarding Bacillus sp. P5, subtilosin A, surfactin and iturin A were identificated. Among the techniques employed for purification, the best results were seen with butanol extraction followed by reverse phase chromatography on C18 column and HPLC coupled to MALDI-TOF mass spectrometry for analysing culture supernatant. Foranalyzing the substances directly into the food matrix,by reverse chromatography was replacedby an adapted method of extraction with butanol using a C4 column (zip tip). The isolated Bacillus sp. P5 is able to coproduce five (5) different types of lipopeptides (surfactin, fengicin, iturin, micosubtilin and bacilomicin) and therefore presents varied activity of biocontrol. Furthermore, this study demonstrated the high production of different isoforms of surfactin (C13 - C17) in the culture medium, including the C15 isoform, the most biologically active isoform, and C17, rarely described as well as the first detection of lipopeptides as fengicin and iturin directly in manioc food matrix. This food is widely consumed by populations in northern and northeastern Brazil and the knowledge about these substances could contribute to increased food safety and shelf life of this type of food