Desenvolvimento e padronização de um teste ELISA para detecção de anticorpos (IgG) anti-Anaplasma marginale em bovinos submetidos ao processo de premunição

Um sistema ELISA usando antígeno bruto foi desenvolvido para detecção de anticorpos anti-A. marginale no soro de bovinos. O antígeno foi produzido a partir do sangue de um bezerro esplenectomizado e previamente inoculado com 5xl0 8 hemácias parasitadas, preservadas em nitrogênio liquido. Durante o pico da parasitemia, o sangue foi colhido e, após centrifugação, o plasma e a camada de leucócitos foram descartados. O sedimento obtido foi dividido em duas partes. Em uma parte os leucócitos foram eliminados pela filtração através de coluna contendo areia do mar. Após a filtração, uma porção do material filtrado foi congelada a 70°C com DMSO 30% em PBS. A outra porção do material filtrado foi lisada com uma solução de cloreto de amônia (NH4Cl) 0,9% e congelada a -20°C. A parte do sedimento inicial não filtrada em coluna de areia foi também dividida em duas porções onde uma foi congelada com DMSO 30% e a outra lisada com uma solução de NH4C1 0,9%. Posteriormente todas as preparações foram sonicadas e os sedimentos obtidos após centrifugação foram solubilizados com Triton X-100. Após a sonicação as preparações foram examinadas através da microscopia eletrônica de transmissão. Estruturas típicas do Anaplasma foram visualizadas apenas na preparação antigênica filtrada através da coluna de areia e congelada com DMSO. Diluições ótimas do antígeno e soros referência positivo e negativo foram determinadas por titulação em bloco e o valor discriminante ("cut oft") foi determinado pela média da leitura de 39 soros negativos acrescida de dois desvios padrão. O exame de 337 amostras de soro de bovinos importados e submetidos ao processo de premunição indicou que o ELISA apresentou maior especificidade (94,87%) que a reação de imunofluorescência indireta (71,79%).An ELISA test using crude antigen was developed for detecting antibodies against A. marginale in bovine sera. The antigen was produced by inoculation of a splenectomized calf with approximately 5xl08 parasited erythrocytes stored in liquid nitrogen. During the peak of parasitaemia, blood was collected and after centrifugation the plasma and buffy coat were discarded. In half of the pellet the leukocytes were removed by filtration through a column containing sea sand. One part of the material was stored at 70°C with DMSO 30% within Phosphate Buffer Saline (PBS) and another was lysed with NH4Cl 0,9% and stored at -20°C. The other half of the pellet was divided into two parts. One part was stored at 70°C with DMSO 30% within PBS and another was lysedwith NH4C1 0,9% and stored at -20°C. Later all preparations were disrupted by sonication and the sediments were solubilized with Triton X-l0O. After each procedure, electron micrograph of the antigenic preparations were carried out. Typical Anaplasmal structures were seen only in the antigenic preparation from which the leukocytes had been removed and the erythrocytes had been stored with DMSO 30%. Optimal dilutions of the antigen, positive and negative reference sera were determined by chequerboard titrations and the cut off value was determined by the mean reading of 39 negative reference sera increased by two standard desviations. The ELISA sistem showed higher specificity (94,87%) than the IFAT (71,79%)