Expressão, cristalização e determinação estrutural de macromoléculas biológicas por difração de raios X por monocristal

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-14T14:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dis_ludmilaleroy.pdf: 33724636 bytes, checksum: 5333e54e6a0c8ba16eb3d048af049b0f (MD5) Previous issue date: 10A função e a forma de proteínas estão intimamente ligadas. A compreensão da estrutura tridimensional delas se faz então necessária na elucidação detalhada dos processos biológicos nos quais elas participam. A cristalografia é uma poderosa técnica empregada na determinação estrutural de proteínas. Vasto conhecimento de física e bioquímica são necessários na capacitação de um profissional apto a trabalhar em todas as etapas do processo envolvido na determinação estrutural por cristalografia de proteínas. O objetivo do presente trabalho foi visitar todas essas etapas, que incluem expressão proteica por técnicas de DNA recombinante, a purificação e a cristalização da proteína, experimentos de difração de raios X por monocristal (XRD), processamento de dados, solução da estrutura e análises do modelo proposto. Para realizar todas as etapas, três proteínas foram estudadas: uma efingomielinase D (SMase D), o domínio E2 do papiloma vírus bovino tipo 1 (E2 de BPV-­¿1) e o complexo NahK/NahL. O trabalho com cada uma das proteínas cobriu partes distintas do processo de determinação estrutural. Foi feita a expressão, purificação, cristalização e experimentos de XRD com cristais da SMase D; a estrutura do domínio E2 de BPV-­¿1 foi elucidada a partir de dados de XRD e o modelo foi devidamente analisado; e os dados de XRD de um cristal de NahK/NahL, que indicaram uma desordem no mapa de densidade eletrônica experimental, foram devidamente reprocessados e analisados, resultando na proposta de um novo modelo para a estrutura do complexo.Proteins¿ shape and function are intimately related. Hence, the comprehension of their tridimensional structures is necessary for the detailed elucidation of the biological processes in which they participate. Crystallography is a powerful technique applied on protein structure determination. Great knowledge of Physics and Biochemistry is needed when capacitating a professional to be able to work on every stage of the process of structure determination by protein crystallography. The present work aimed at visiting every one of those stages, including recombinant protein expression, protein purification and crystallization, X-ray diffraction experiments (XRD), data processing, structure solution and analyses. To cover the whole process, three proteins were studied: a sphingomyelinase D (SMase D), the bovine papillomavirus-1 E2 DNA binding domain (BPV-1 E2) and the NahK/NahL complex. Different parts of the process of structure determination were covered working with each of the proteins. SMase D was expressed, purified and crystallized and XRD experiments were performed with its crystals; the structure of BPV-1 E2 was elucidated from XRD data and the proposed model was properly analyzed; XRD data from a crystal of the NahK/NahL complex, which indicated an unordered region on the experimental electron density map, were reprocessed and analyzed, resulting on the proposition of a new structural model of the complex