Estudo do envolvimento da enzima formil-transferase na biossíntese do LPS da Brucella abortus e avaliação da persistência e proteção de uma linhagem mutante para este gene de camundongos C57BL/6 e defifientes para IRF-1

Os membros do gênero Brucella são bactérias Gram-negativas, intracelulares facultativas que podem causar infecções crônicas em mamíferos. Várias tentativas têm sido feitas com o objetivo de se obter uma vacina eficaz para esta doença. No entanto, apesar de conferir proteção, as vacinas comerciais atualmente disponíveis apresentam desvantagens, tais como a interferência no diagnóstico de animais infectados e resistência a antibióticos. Considerando LPS Brucella de um dos seus principais fatores de virulência, nós interrompemos o gene wbkC da Brucella abortus, que está relacionado com a biossíntese do seu LPS. Mais especificamente, o gene wbkC catalisa a conversão de GDP-4-NH2-4,6 dideoximanose em GDP-4-formamido-4,6 dideoximanose, que é a unidade monomérica do antígeno-O presente no LPS da Brucella. Neste trabalho foram gerados mutantes pela estratégia de recombinação homóloga dupla para a linhagem selvagem Brucella abortus S2308 vacinal e S19. Nas análises in vitro realizadas em macrófagos de medula óssea, foram observadas alterações na sobrevivência e tráfico intracelular dos mutantes em comparação com as linhagens parentais. Também foram realizados experimentos in vivo em camundongos C56BL/6 e knockout para IRF-1 (fator regulador de interferon-1). As linhagens mutantes wbkC apresentaram uma menor persistência em ambos os modelos murinos analisados, mostrando o papel fundamental deste gene na virulência da Brucella abortus. Experimentos de proteção revelaram que as linhagens mutantes wbkC induziram uma menor imunidade protetora em camundongos C56BL/6 quando comparados à linhagem vacinal lisa S19, no entanto o mutante ÄwbkC S2308 mutante apresentou o mesmo nível de proteção observado para a cepa da vacina rugosa RB51.Members of genus Brucella are Gram negative, facultative intracellular bacterial pathogens that can cause chronic infections in mammals. Several attempts to get an efficient vaccine have been developed. However, in spite of conferring protection, the vaccines currently commercial available show disadvantages as diagnostic interference and resistance to antibiotics. Considering Brucellas LPS one of its main virulence factors, we disrupted Brucella abortus wbkC gene which is related to LPS biosynthesis pathway. More specifically, wbkC catalyzes the GDP-4-NH2-4,6 dideoximanose conversion in GDP-4-formamido-4,6 dideoximanose, the monomeric unit of antigen-O present in Brucella LPS. Mutants for smooth wild type Brucella abortus S2308 and vaccine strain S19 were generated by double recombination strategy. In vitro analyses were performed in bone marrow macrophages, were we observed alteration in intracellular survival and trafficking of the mutants compared to the parental strains. In vivo experiments in C56BL/6 and IRF-1 (interferon regulation factor-1) knockout mice models were also performed. wbkC mutants had a lower persistence in both mice models, showing the critical role of the selected gene for full bacterial virulence. Challenge experiments revealed that wbkC mutant strains induced lower protective immunity in C56BL/6 when compared to smooth vaccine strain S19, however ÄwbkC 2308 mutant could induce the same level of protection observed for rough vaccine strain RB51