Diagnóstico e quantificação de toxoplasma gondii através de PCR em tempo real em sangue periférico de recém-nascidos com toxoplasmose congênita no estado de Minas Gerais

A transmissão congênita do Toxoplasma gondii em humanos tem sido associada à ocorrência de abortos, natimortos e mortalidade neonatal. Recém-nascidos infectados podem apresentar hidrocefalia, retinocoroidite, calcificações cerebrais e retardo mental ou perturbações neurológicas. A maioria das crianças infectadas que nascem sem sintomatologia aparente, quando não tratadas, podem desenvolver lesões oculares tardias. As estratégias de diagnóstico (sorológico ou parasitológico) comumente utilizadas possuem limitações que dificultam e/ou atrasam o diagnóstico precoce da toxoplasmose congênita, essencial para o início do tratamento e consequente melhora no prognóstico da doença. Esse trabalho tem por objetivo identificar a presença do T. gondii no DNA extraído do sangue periférico de recém-nascidos infectados. A técnica de qPCR, utilizando uma sequência repetitiva do genoma do parasito (rep529) foi testada como uma alternativa para o diagnóstico rápido da toxoplasmose congênita. O resultado de 183/220 (83,2%) amostras foi considerado pela ausência de inibidores de PCR ou produtos inespecíficos. Em 84/183 (45,9%) das amostras a presença do parasito foi confirmada pela amplificação do alvo rep529. A técnica de qPCR-rep529 obteve boa reprodutibilidade (82,86%). Doze amostras (6,5%) com diagnóstico molecular positivo foram negativos para a pesquisa de IgG após 12 meses de vida. Não foi observada associação entre a qPCR-rep529 e a presença de calcificações cerebrais, entretanto, em relação à presença de lesão ocular, a diferença foi significativa (p= 0,013), O risco relativo (RR) de uma criança ter toxoplasmose ocular, dado que a qPCR foi positiva, é 1,8 vezes maior do que em uma criança, previamente triada como positiva, onde a qPCR foi negativa Considerando os tipos de lesão foi demonstrado que as crianças com retinocoroidite ativa possuem RR de 2,3 (p = 0,009) e as com retinocoroidite cicatrizada de 1,9 (p = 0,034). Através da quantificação do número de parasitos presentes no sangue periférico dos recém-nascidos foi avaliada uma possível associação entre a carga parasitária e a idade das crianças ou os principais sinais clínicos apresentados pelas crianças infectadas: calcificações cerebrais e retinocoroidite. A carga parasitária encontrada nas crianças foi pequena, 68% das amostras positivas apresentavam o número estimado de parasitos menor que 0,5 taquizoíto/mL de sangue periférico. As crianças possuíam em média 58 meses de vida e não foi observada associação significativa entre a idade das crianças e a carga parasitária. Da mesma forma não foi observada associação entre a presença de calcificações cerebrais ou a presença de retinocoroidite e a carga parasitária. Foi observada uma variação intraespecífica no número de cópias do alvo rep529 em oito cepas de genótipo recombinante e fenótipo virulento para camundongos isoladas recentemente de casos congênitos.Congenital toxoplasmosis has been associated with the occurrence of abortion, stillbirths and neonatal mortality. Infected newborns may have hydrocephalus, retinochoroiditis, cerebral calcifications and mental retardation or neurological disorders. Most infected children who are born asymptomatic, but without specific treatment, may develop late ocular lesions. Strategies for diagnosis (serological or parasitological) have limitations that difficult and/or delay the diagnosis of congenital toxoplasmosis that is essential for the early beginning of treatment and improvement in disease outcomes. This study aims to identify the presence of Toxoplasma gondii in DNA extracted from newborns peripheral blood. The qPCR technique, using a repetitive sequence of the parasite genome (rep529), was tested as an alternative tool for congenital toxoplasmosis fast diagnosis. Results of 183/220 (83,2%) samples was considered. Results of 37/220 (16,8%) were not available because they have PCR inhibitors or nonspecific products. In 84/183 (45.9%) samples the parasite presence was confirmed by amplification of the target rep529. The qPCR-rep529 has good reproducibility (82.86%). Twelve samples (6.5%) had positive molecular diagnosis despite absence of IgG after 12 months of life. There was no association between qPCR-rep529 and presence of cerebral calcifications, however, regarding the presence of ocular injury, the difference was significant (p = 0.013), with a relative risk (RR) of 1.8. Considering types of ocular lesion, it was demonstrated, that children with active retinochoroiditis have RR of 2.3 (p = 0.009) and those with healed retinochoroiditis have RR of 1.9 (p = 0.034). Quantification of peripheral blood parasites from infected newborns was done through qPCR-rep529. Children has small parasite load, 68% of positive samples has less than 0.5 tachyzoite parasites / ml of peripheral blood. The mean age of children were 58 months of life, however, time of life was not associated with parasite load. It was not possible to associate parasite load to the presence of cerebral calcifications or retinochoroiditis. There was intraspecific variation in the number of copies of the target rep529 when eight recombinant strains of T. gondii isolated from humans were analyzed