Efeitos in vivo e in vitro da cafeína sobre a diferenciação osteogênica das células tronco mesenquimais e atividade de síntese de osteoblastos e condrócitos de ratos

A cafeína é um alcaloide ativo que pode causar danos aos tecidos ósseo e cartilaginoso desde a formação do esqueleto na vida pré-natal até a vida adulta. Esse composto passa para a prole através da placenta e do leite, causando redução da formação e do crescimento ósseo. A hipótese deste estudo é que as células tronco mesenquimais (CTMs), os osteoblastos e os condrócitos, responsáveis por originar o esqueleto, possam ser alvos da cafeína. Para tentar elucidar os mecanismos celulares e moleculares pelos quais a cafeína atua sobre essas células, foram realizados quatro experimentos distintos. O objetivo foi avaliar o efeito da cafeína sobre a diferenciação osteogênica das CTMs da medula óssea (experimento 1), atividade de síntese de osteoblastos da calvária (experimento 2) e a atividade de síntese de condrócitos (experimento 3), extraídos da prole de ratas mães que receberam 25, 50 e 100mg/Kg de cafeína durante a gestação (experimento 2 e 3) ou durante a gestação e lactação (experimento 1). No quarto experimento, o objetivo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de cafeína, adicionadas ao meio de cultura, sobre a atividade de síntese de condrócitos extraídos de ratos neonatos. No primeiro e segundo experimentos, foram avaliados a viabilidade celular, a atividade da fosfatase alcalina, a síntese de colágeno e de nódulos mineralizados e a expressão dos transcritos gênicos para osteocalcina, osteopontina, sialoproteína óssea, fosfatase alcalina, colágeno tipo I e Runx-2 por qRT-PCR. No terceiro e quarto experimentos, foram avaliados a viabilidade celular e a atividade de síntese por meio de análises citoquímicas, morfométricas e da quantificação dos transcritos gênicos para Sox-9, Runx-2, agrecano, colágeno tipo II e fosfatase alcalina por qRT-PCR. Os dados dos quatro experimentos foram submetidos a ANOVA com comparação das médias pelo teste SNK. Diferenças foram consideradas significativas se p0,05. Nas CTMs, as doses de 50 e 100mg/Kg de cafeína reduziram a atividade da fosfatase alcalina em todos os períodos estudados e a expressão de colágeno tipo I aos 21 dias. A expressão dos transcritos gênicos para fosfatase alcalina, Runx-2 e sialoproteína óssea e a síntese dos nódulos mineralizados reduziu em todas as doses de cafeína (experimento 1). Os osteoblastos extraídos de filhos de ratas que receberam cafeína na dose de 50mg/Kg durante a gestação apresentaram aumento da síntese de transcritos gênicos para osteocalcina, osteopontina, sialoproteína óssea, fosfatase alcalina e colágeno tipo I, resultando em aumento da síntese de nódulos mineralizados (experimento 2). Nas culturas de condrócitos de todos os grupos tratados com cafeína os efeitos não foram lineares ou dose-dependentes. As culturas de condrócitos extraídos dos grupos tratados com a dose de 25 mg/Kg foram as que apresentaram os menores valores, com redução da viabilidade e da porcentagem de células, da atividade da fosfatase alcalina, da síntese de colágeno e de matriz condrogênica, bem como da expressão de Sox-9, fosfatase alcalina e colágeno tipo I. Culturas de condrócitos do grupo tratado com 50 mg/Kg de cafeína apresentaram redução da síntese de colágeno e da expressão de Sox-9. A dose de 100 mg/Kg reduziu a síntese de colágeno, bem como a expressão de Sox-9 e de fosfatase alcalina (experimento 3). In vitro, a cafeína reduziu significativamente e de forma dose-dependente a redução do MTT em cristais de formazan, a porcentagem de células/campo, a síntese de colágeno, a atividade da fosfatase alcalina e a síntese de matriz condrogênica PAS+, safranina O+, alcian blue+, bem como a expressão dos transcritos gênicos para agrecano, Sox-9 e colágeno tipo II (experimento 4). Conclui-se que os efeitos da cafeína são variáveis de acordo com sua ação in vivo ou in vitro, com sua concentração ou dose e com o tipo de célula sob a qual ela esteja atuando. De forma geral, os efeitos in vivo da cafeína sobre as células tronco e os condrócitos e o efeito in vitro sobre os condrócitos é negativo e danoso, enquanto que seus efeitos in vivo sobre os osteoblastos, nas mesmas doses testadas sobre as CTMs e os condrócitos, são contrários, aumentando a viabilidade e a atividade de síntese dessas células.Caffeine is an active alkaloid that can cause damage to bone tissue and cartilage in formation during prenatal life and into adulthood. This compound is transfered to offspring through the placenta and milk, causing a reduction in the bone formation and growth. The hypothesis of present study is that mesenchymal stem cells (MSCs), osteoblasts and chondrocytes, responsible for originating the skeleton, can be targets of caffeine. To try to elucidate the cellular and molecular mechanisms by which caffeine acts on these cells, four separate experiments were performed. The objective was to evaluate the effect of caffeine on the osteogenic differentiation of MSCs from bone marrow (experiment 1), osteoblast synthesis activity of the calvaria (experiment 2), and chondrocyte synthesis activity (experiment 3), obtained from rat offspring of dams who received 25, 50 and 100mg/Kg of caffeine during pregnancy (experiment 2 and 3) or during pregnancy and lactation (experiment 1). In the fourth experiment, the objective was to evaluate the effect of different concentrations of caffeine, added to the culture medium on chondrocyte synthesis activity extracted from newborn rats. In the first and second experiments, we assessed cell viability, alkaline phosphatase activity, collagen synthesis and mineralized nodules and expression of gene transcripts for osteocalcin, osteopontin, sialoprotein, alkaline phosphatase, collagen I and Runx-2 by qRT-PCR. In the third and fourth experiments, we assessed cell viability and activity of synthesis by cytochemical analysis, morphometric and quantification of gene transcripts for Sox-9, Runx-2, aggrecan, collagen II and alkaline phosphatase by qRT-PCR. The data from the four experiments were analyzed by ANOVA to compare the means by SNK test. Differences were considered significant if p 0.05. In MSCs, doses of 50 and 100 mg/Kg of caffeine reduced the activity of alkaline phosphatase in all periods studied and the expression of collagen I at 21 days. The expression of gene transcripts for alkaline phosphatase, Runx-2 and bone sialoprotein and synthesis of mineralized nodules reduced in all doses of caffeine (experiment 1). Osteoblasts obtained from offspring of rats that received caffeine at a dose of 50mg/Kg during pregnancy showed an increase in gene transcripts synthesis for osteocalcin, osteopontin, sialoprotein, alkaline phosphatase and collagen type 1, resulting in increased synthesis of mineralized nodules (experiment 2). In chondrocyte cultures from all groups treated with caffeine, effects were non-linear or dose-dependent. The chondrocyte cultures obtained from groups treated with the dose of 25 mg/Kg showed the lower values, reducing viability and percentage of cells, alkaline phosphatase activity, collagen synthesis and chondrogenic matrix, as well as the expression of Sox-9, alkaline phosphatase and collagen I. Chondrocyte cultures of group treated with 50 mg/Kg of caffeine decreased collagen synthesis and expression of Sox-9. The dose of 100 mg/Kg reduced the collagen synthesis, as well as the expression of Sox-9 and alkaline phosphatase (experiment 3). In vitro, caffeine reduced significantly and dose-dependent manner the conversion of MTT into formazan, the percentage of cells/field, collagen synthesis, alkaline phosphatase activity and synthesis of chondrogenic matrix PAS +, safranin O +, alcian blue + as well as the expression of gene transcripts for aggrecan, Sox-9 and II collagen (experiment 4). It is concluded that the effects of caffeine vary according to their action in vivo or in vitro, with their concentration or dose and the type of cell in which it is acting. Overall, the in vivo effects of caffeine on stem cells and chondrocytes and the in vitro effect on chondrocytes is negative and harmful, while their in vivo effects on osteoblasts, the same doses tested on MSCs and chondrocytes, are contrary, increasing the viability and synthesis activity of these cells