Potencial de uso biotecnológico de lipase de Colletotrichum gloeosporioides e antioxidantes de Morus alba

Este trabalho visou o estudo do fungo Colletotrichum gloeosporioides e da planta Morus alba quanto ao seu potencial biotecnológico. Para isto, foram realizadas a produção, purificação parcial, caracterização e teste de aplicação da lipase de C. gloeosporioides bem como avaliação da capacidade antioxidante de raízes de 12 variedades de Morus alba. A atividade lipásica máxima (0,742 U.mL-1) do preparado enzimático contendo lipase foi obtida após fermentação de C. gloeosporioides em substrato líquido por 48 h. A proteína lipolítica no preparado enzimático apresentou massa molecular de aproximadamente 18 kDa, mostrou-se estável em pH 5- 8, retendo 40 % de sua atividade em pH 9 e cerca de 30 e 25 % em pH 10 e 11, com pH 10 sendo seu ótimo de reação. Apresentou ainda estabilidade de 5 h na temperatura ótima (37 ºC), estabilidade frente a alguns sais (NH4+, Mg+2, Ca+2, Mn+2, Sn+2) e solventes (metanol, etanol, isopropanol, butan-1-ol, acetonitrila, heptano e hexano) em diferentes concentrações. A lipase apresentou atividade de esterificação (70 % de rendimento na formação de butirato de butila) e transesterificação (rendendo 5,4.10-3 U/kg.min com a reação entre propanol e p-nitrofenilpalmitato). A enzima foi capaz de gerar concentrados de ácidos graxos livres e na forma de acilglicerois a partir de todas as matérias primas testadas, com maiores graus de hidrólise sobre óleo de oliva (18,0 U), soja (17,8 U) e canola (15,9 U). Uma sequência de ultrafiltração com corte de 10 kDa, filtração em gel e cromatografia de afinidade com benzamidina possibilitou a obtenção de sete frações parcialmente purficadas. A fração 1, proveniente da filtração em gel seguida da cromatografia de afinidade alcançou a melhor combinação rendimento/fator de purificação, com recuperação de 27,15 % da atividade lipolítica, fator de purificação alto (20,51) e temperatura ótima em torno de 40 °C. As características físico-químicas e catalíticas da enzima demonstraram sua aplicabilidade na indústria alimentícia, na produção de ácidos graxos e ésteres aromáticos empregados como flavor, bem como na indústria de detergente. Para a avaliação do potencial biotecnológico de M. alba, extratos aquosos, etanólicos e hexânicos de 12 variedades naturais e híbridas de raízes de M. alba foram utilizados. Verificaram-se diferenças entre as variedades como o conteúdo fenólico entre extratos hexânicos (0,55 1,59), aquoso (2,72 6,61) e etanólicos (5,09 9,84 g de ácido gálico /100 g de extrato). A ação antioxidante de M. alba foi comprovada por diferentes ensaios, como 47 % de atividade antioxidante (poder redutor férrico) comparado com o padrão de ácido ascórbico. A capacidade de sequestro de radicais livres também foi observada em extratos de M. alba. O etanol foi muito eficiente na extração de compostos fenólicos e flavonoides e os extratos etanólicos apresentaram as maiores atividades antioxidantes. Na variedade IZ 64 detectaram-se alto conteúdo fenólico e de flavonoides, bem como melhor capacidade de captura de radicais livres e redução do ferro. Essa variedade foi a melhor para exploração econômica e uso como antioxidante na preservação de alimentos ou na formulação de nutracêuticos. Esse trabalho permitiu verificar o potencial de uso de lipase de C. gloeosporioides na hidrólise de diferentes óleos para produção de concentrados de ácidos graxos bem como na produção de butirato de butila, aromatizante da indústria de alimentos com aroma de abacaxi. Além disso, foi observado o potencial antioxidante das raízes de M. alba com a variedade IZ 64 demonstrando maior potencial para exploração econômica.This work aimed to study biotechnological potential of the fungal species Colletotrichum gloeosporioides and the plant Morus alba. Production, partial purification, characterization and application tests for Colletotrichum gloeosporioides lipase as well as evaluation of the difference in antioxidant capacity in 12 varieties of Morus alba roots were screened. Maximum activity (0.742 U.mL-1) of the preparation containing lipase was obtained after fermentation of C. gloeosporioides in liquid substrate for 48 h. The lipolytic protein presented molecular mass of approximately 18 kDa, was stable at pH 5-8, holding 40% of its activity at pH 9 and about 30 and 25% at pH 10 and 11, with pH 10 being optimum pH. The enzyme was stable for five hours on optimum temperature (37 °C), stable in salts solutions (NH4+, Mg+2, Ca+2, Mn+2, Sn+2) and solvents (methanol, ethanol, isopropyl alcohol, butyl alcohol, acetonitrile, heptane e hexane) in different concentrations. The lipase presented esterification activity (70 % yield in the formation of butyl butyrate) and transesterification (yielding 5.4.10-3 U.kg-1.min-1 with the reaction between isopropyl alcohol and p-nitrophenylpalmitate). The enzyme generated free fatty acids and glycerides concentrates from all raw materials tested, with greater degrees of hydrolysis on olive oil (18.0 U), soybeans (17.8 U) and canola (15.9 U). A sequence of ultrafiltration with 10 kDa, gel filtration, and affinity chromatography with benzamidine allowed obtaining fractions partially purified. Fraction "1", obtained from affinity chromatography, reached the best combination of activity recovery (%)/purification fator (27.15/20.51) and optimum temperature around 40 °C. The physico-chemical and catalytic characteristics demonstrated applicability of this enzyme in the food industry, in the production of essential fatty acids and aromatic esters employed as flavor, as well as in detergent industry. To evaluate the biotechnological potential of M. alba, aqueous, ethanol and hexane extracts of 12 natural and hybrid varieties of M. alba roots were used. Differences between the varieties were observed, such as the phenolic content of the hexane (0.55-1.59), aqueous (2.72-6.61) and ethanol extracts (5.09 9.84 g of Gallic acid/100 g of extract). The antioxidant action of M. alba was proven by different tests, finding, for instance, 47 % of iron reduction compared to ascorbic acid. The ability of free radicals sequestration was also observed in extracts of M. alba. Ethanol was very efficient in extracting phenolic compounds and flavonoids, then ethanol extracts demonstrated the greatest antioxidant activities. The variety IZ 64 showed high phenolic content and flavonoids, as well as better ability to capture free radicals and iron reduction, showing to be the best variety for economic exploitation and use as antioxidants for food preservation or as a nutraceutical. This work has shown the potential use of lipase from C. gloeosporioides on hydrolysis of different oils for the production of fatty acids as well as in the production of butyl butyrate, flavouring the food industry with flavor of pineapple. In addition, it was observed the antioxidant potential of the roots of M. alba with IZ 64 demonstrating great potential for economic exploitation