Proteases secretadas por amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba de diferentes genótipos

As amebas do gênero Acanthamoeba são organismos de vida livre presentes nos mais variados ambientes, e eventualmente causam graves infecções no ser humano, como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite por Acanthamoeba. Diferentes espécies de Acanthamoeba foram descritas e atualmente são classificadas em mais de 20 diferentes genótipos, com base em sequências do 18S rDNA. Um fator relacionado à patogenia e virulência de Acanthamoeba é a capacidade de secretar proteases, que parecem estar envolvidas na patogênese da infecção. Alguns estudos têm avaliado o perfil quantitativo e qualitativo desses produtos de secreção, buscando correlações com a virulência entre diferentes linhagens. O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise comparativa do perfil de proteases secretadas por amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba de diferentes genótipos, e avaliar se ocorre alteração desse perfil após a interação com células de cultivo MDCK. Seis isolados de Acanthamoeba de origem clínica e ambiental, sendo três pertencentes ao genótipo T4 e as demais de genótipo T1, T2, e T11, foram cultivados em meio PYG a 32o C. Os isolados foram avaliados por curva de crescimento e efeito citopático sobre células MDCK. Para os ensaios de zimografia e azocaseína, utilizou-se meio condicionado a 32º C, por 24 horas. O meio condicionado também foi obtido de culturas interagidas por três dias consecutivos com células MDCK. O crescimento dos isolados foi variado e todos produziram efeito citopático. Os perfis de zimografia variaram entre os isolados, que apresentaram proteases de massa molecular entre 170 e 58 kDa, a maioria identificada pelo uso de inibidores como serinoproteases. O isolado de genótipo T1, obtido de poeira ambiental, apresentou maior produção de proteases que os demais e uma provável cisteínoprotease de alto peso molecular, ainda não descrita para esse genótipo (170 kDa). Após a interação com células MDCK, houve alteração do perfil de zimografia em todos os isolados, com a supressão de algumas proteases e o surgimento de outras, de baixa massa molecular (<60 kDa) e de uma protease que poderia ser a MIP-133 (protease induzida por manose). A quantidade de proteases das amostras interagidas foi menor que a das não interagidas. O presente estudo mostrou pela primeira vez o perfil de proteases secretadas por Acanthamoeba de genótipo T11 e uma possível cisteínoprotease em genótipo T1. As alterações no perfil qualitativo e quantitativo de proteases após a interação com células MDCK indica que Acanthamoeba pode modular fatores associados à patogenicidade, o que representa um mecanismo adaptativo para sua sobrevivência como parasita.Amoebae of the genus Acanthamoeba are free-living organisms found in a wide range of environments, but eventually cause serious infections in humans, as granulomatous amoebic encephalitis and Acanthamoeba keratitis. Different species of Acanthamoeba have been described classified currently in more than 20 genotypes, based on 18S rDNA sequences. A factor related to the pathogenesis and virulence of Acanthamoeba is its ability to secrete proteases that seems to be involved in the pathogenesis of the infection. Some studies have assessed the quantitative and qualitative profile of these secretory products, seeking correlations with the virulence of different strains. The aim of this study was to perform a comparative analysis of the profile of secreted proteases for clinical and environmental samples of Acanthamoeba of different genotypes, and assess whether a change occurs after interaction with MDCK cells. Six clinical and environmental isolates of Acanthamoeba, belonging to genotypes T1 (one), T2 (one), T4 (three) and T11 (one), were grown in PYG medium at 32° C. Growth curves and cytopathic effect assay were performed, and trophozoites were incubated for 24 hours at 32°C to produce conditioned medium for zymography and azocasein assays. The conditioned medium was also obtained after the interaction with MDCK cells for three consecutive days. Zymography profiles varied among the isolates, that showed protease with molecular weight between 170 and 58 kDa, most identified as serine proteases. T1 genotype isolate obtained from environmental dust, showed quantitatively higher production of proteases than the others and a possible cisteinoprotease with high molecular weight (170 kDa). After interacting with MDCK cells, there was a change of zymography profile in all isolates, with the lifting of certain proteases and the emergence of others, including several low molecular weight (