Construção de um vírus Vaccínia Ankara Modificado (MVA) Recombinante expressando a proteína e do vírus Dengue 3

A dengue é hoje objeto da maior campanha de saúde pública do Brasil, encontrando-se presente nos 27 estados da Federação. Visto que, as campanhas de combate ao vetor foram historicamente mal sucedidas, o desenvolvimento de uma vacina antidengue, ainda não existente, torna-se a opção mais segura para o controle desta arbovirose urbana. Os vírus MVA pertencentes à família Poxviridae, podem ser utilizados como um vetor poxviral vacinal antidengue possuindo vantagens como: ser incapaz de se multiplicar em células de mamíferos, métodos de construção e manipulação genéticos são relativamente simples, baseados principalmente no fenômeno de recombinação homóloga, seu genoma suporta a inserção de enormes quantidades de DNA exógeno, proteínas produzidas são processadas e transportadas de maneira idêntica ao que ocorre nas células de origem do gene estudado, dentre outras. Neste trabalho foram realizadas técnicas de biologia molecular para a construção de uma vacina recombinante contra o sorotipo 3 de Dengue, sorotipo mais prevalente no Brasil. Inicialmente foi realizada uma RT-PCR de uma amostra clínica positiva de DEN3, com o intuito de amplificar a região do genoma que codifica a proteína E. A proteína E é a maior e a principal proteína do envelope viral, sendo também o principal alvo de anticorpos neutralizantes o que revela o importante potencial que esta proteína pode possuir na construção de uma vacina recombinante. Subseqüentemente, a região que codifica a proteína para DEN 3 E foi inserida num plasmídeo de clonagem e seqüenciada, na etapa seguinte, DEN3 E foi introduzida no plasmídeo de transferência pLW44. Células de fibroblasto de embrião de galinha (CEFs) foram preparadas para que ocorresse infecção por MVA, que se multiplicam muito bem nestas células, e transfecção com o plasmídeo de pLW44-DEN3-E afim de se avaliar a funcionalidade desta construção. O sucesso desta etapa foi confirmado pelo ensaio de western blot. Os resultados obtidos até agora sugerem que este projeto foi relevante para a obtenção da vacina tetravalente almejada pelo grupo.Dengue is now the subject of the largest public health campaign in Brazil and is present in 27 states of the Federation. However, because the campaigns to combat the vector have been historically unsuccessful, the development of an antidengue vaccine, yet non-existent, is the safest option for the control of this urban arbovirus disease. The MVA virus belongs to the Poxviridae family, if used as a viral vector in antidengue immunization, has many advantages such as: being unable to multiply in mammalian cells, easy methods of construction, its genetic manipulation is relatively simple, based mainly on the phenomenon of homologous recombination, its genome supports the introduction of enormous quantities of exogenous DNA, proteins produced are processed and transported in a way similar to that happens in the origin cells from the gene studied, among others. Here, we report the construction of a recombinant monovalent vaccine against the Dengue virus serotype 3, the serotype more prevalent in Brazil. The E protein is the largest and the main protein of the viral envelope, and also the main target for neutralizing antibodies, which shows the great potential that this protein may have in recombinant vaccine building. We obtained a Dengue E cDNA and subsequently inserted it into a shuttle plasmid. Chicken embryo Fibroblast cells (CEFs) were inoculated with MVA and transfected with the shuttle plasmid, allowing for homologous recombination between the virus and plasmid. The obtained recombinant virus was able to express the E protein of Dengue virus serotype 3, as demonstrated by the western blot