Regulação dos neurônios KNDy pelo estradiol: papel da kisspeptina e dinorfina no controle da secreção de prolactina e hormônio luteinizante

Os neurõnios produtores de kisspeptina, neurocinina e dinorfina (KNDy) do núcleo arqueado (ARC) estão envolvidos na secreção pulsátil de hormônio luteinizante (LH). Evidências anteriores também mostraram que os neurônios KNDy enviam projeções para os neurônios tuberoinfundibular dopaminérgicos (TIDA), que estão envolvidos na secreção de prolactina (PRL). Em roedores, o estradiol (E2) é capaz de induzir picos pré-ovulatórios simultâneos de LH e PRL. Neste trabalho, testamos a hipótese de que os neurónios KNDy participem da regulação da secreção de PRL pelo E2. A atividade dos neurónios KNDy foi avaliada utilizando dupla marcação imunohistoquímica para c-Fos e kisspeptina no ARC. O número de neurônios kisspeptina -imunorreativos (ir) foi menor no proestro e estro comparado com o diestro. No entanto, a porcentagem de neurônios de kisspeptina-ir expressando c-Fos foi aumentada na tarde do proestro, momento dos picos de LH e PRL, resultado este confirmado utilizando -se dois anticorpos anti-c-Fos. Os ratos machos, por sua vez, exibiram menor número de neurônios kisspeptina-ir no ARC do que fêmeas em diestro, com coexpressão inalterada de c-Fos durante o dia. Os efeitos do E2 foram avaliados no modelo de retroalimentação positiva de ratas ovariectomizadas (OVX) tratadas com E2 (OVX+E2). O número de neurônios kisspeptina-ir no ARC foi menor em ratas OVX+E2 em comparação às OVX. De forma semelhante ao proestro, no entanto, a porcentagem de neurônios kisspeptina-ir expressando c-Fos foi aumentada em ratas OVX+E2 às 18:00 h. Esta ativação neuronal e o pico de LH, foram bloqueados pelo anti-estrógeno tamoxifen. Além disso, a ativação de neurônios kisspeptinérgicos em ratas OVX+E2 foi diretamente correlacionada com a atividade do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e inversamente correlacionada com a expressão de tirosina hidroxilase fosforilada (S40pTH) na eminência mediana, utilizada como índice de atividade dos neurônios TIDA. Os efeitos de E2 na expressão dos genes KNDy no ARC foram determinados utilizando-se a reação de transcrição reversa em cadeia de polimerase (RT-PCR tempo real). O E2 inibiu a expressão de Kiss1 e não teve efeito sobre o RNAm de Nkb. Em contrapartida, ratas OVX+E2 apresentaram um aumento do RNAm de prodinorfina (Pdyn) às 18:00 h, coincidindo com os picos de LH e PRL induzidos por E2. Em um experimento adicional, utilizamos ratas transgênicas que expressam Cre-recombinase sob o controle do promotor da TH, para preencher os corpos celulares e dendritos de neurônios TIDA com GFP, permitindo a investigação de aposições de dinorfina e kisspeptina nessas células. As ratas OVX+E2 exibiram maior número de neurônios dinorfina-ir no ARC, em oposição ao menor número de células kisspeptina-ir. O E2 também aumentou o número de aposições dinorfina- ir no soma e dendritos de neurônios TIDA, enquanto diminuiu as aposições kisspeptina-ir. Assim, fornecemos evidências de um efeito dual do E2 sobre os neurônios KNDy. O E2 reduz a expressão de kisspeptina como parte do efeito de retroalimentação negativa sobre a secreção de LH. Concomitantemente, induz um aumento na atividade de neurônios KNDy durante a tarde, maior expressão de dinorfina e aumento dos contatos de dinorfina em neurônios TIDA. Estes achados revelam um mecanismo pelo qual os neurônios KNDy devem controlar a secreção de PRL induzida por E2.Kisspeptin, neurokinin and dynorphin (KNDy) neurons in the arcuate nucleus (ARC) are implicated in luteinizing hormone (LH) pulsatility. Previous evidence has also shown that KNDy neurons have extensive projections onto tuberoinfundibular dopaminergic (TIDA) neurons that are involved in prolactin (PRL) secretion. In rodents, estradiol (E2) induces concurrent preovulatory surges of LH and PRL. We aimed to test the hypothesis that KNDy neurons are major player in regulating this release of PRL. The activity of KNDy neurons was evaluated using double-label immunohistochemistry to c-Fos and kisspeptin in the ARC. The number of kisspeptin-immunoreactive (ir) neurons was lower on proestrus and estrus compared with diestrus. Nevertheless, the percentage of kisspeptin-ir neurons expressing c-Fos was increased on proestrous afternoon by the time of LH and PRL surges, confirmed using two anti-c-Fos antibodies. Male rats, in turn, displayed fewer kisspeptin-ir neurons in the ARC than diestrous females with unchanged coexpression of c-Fos during the day. The effects of E2 were evaluated in the positive-feedback model of ovariectomized (OVX) rats treated with E2 (OVX+E2). The number of kisspeptin-ir neurons in the ARC was reduced in OVX+E2 compared with OVX rats. Similarly to proestrus, however, the percentage of kisspeptin-ir neurons expressing c-Fos was increased in OVX+E2 rats at 18:00 h. This response, as well as the LH surge, was blocked by the anti-estrogen tamoxifen. Moreover, the activation of kisspeptin neurons in OVX+E2 rats was positively correlated with the activity of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons and inversely correlated with the expression of phosphorylated tyrosine hydroxylase (S40pTH) in the median eminence, used as an index of TIDA neuron activity. The effects of E2 on expression of KNDy genes in the ARC were determined using qPCR. E2 inhibited the expression of Kiss1 and had no effect on Nkb mRNA. In contrast, OVX+E2 rats displayed an increased expression of prodynorphin (Pdyn) mRNA at 18:00 h, coinciding with the E2-induced LH and PRL surges. We then used transgenic rats expressing Cre-recombinase under the TH promoter to fill the cell bodies and dendrites of TIDA neurons with GFP, allowing investigation of dynorphin and kisspeptin inputs onto these cells. OVX+E2 rats displayed more dynorphin-ir neurons in the ARC in opposition to less kisspeptin-ir cells. E2 also increased the number of dynorphin inputs on the soma and dendrites of TIDA neurons whereas decreased the kisspeptin ones. Thus, we provide evidence of a dual effect of E2 on the regulation of KNDy neurons. E2 reduces kisspeptin expression as part of the negative-feedback effect on LH. Concurrently, E2 induces an afternoon rise in the activity of KNDy neurons, higher expression of dynorphin and increased dynorphin inputs on TIDA neurons. These findings reveal a novel mechanism through which KNDy neurons may control the E2-induced PRL secretion