Análise molecular do gene prkar1a na odontogênese e nos tumores odontogênicos mistos

Os tumores odontogênicos constituem um grupo raro e heterogêneo que guardam muitas similaridades com os germes dentários. Os tumores derivados do epitélio e ectomesênquima odontogênicos com ou sem a formação de tecido duro são classificados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como tumores odontogênicos mistos (TOM). Neste grupo de tumores se encontram o fibroma ameloblástico (FA), no qual é descrita a transformação da contraparte ectomesenquimal em fibrossarcoma ameloblástico (FSA), o fibrodentinoma ameloblástico (FDA) e o fibroodontoma ameloblástico (FOA). A proteína quinase A dependente de AMPc (PKA) é o principal mediador de AMPc em mamíferos e é um tetrâmero composto por duas subunidades reguladoras e duas catalíticas. Dos genes que codificam as subunidades de PKA, o único em que já foi descrito mutações em neoplasias humanas é o PRKAR1A. O gene PRKAR1A é um gene supressor de tumor que codifica a subunidade reguladora 1 (R1) da PKA. PRKAR1A está envolvido na patogênese dos mixomas odontogênicos, um tumor derivado do ectomesênquima do germe dentário, que exibe perda de expressão da proteína PRKAR1A e presença de mutações. Como os TOM compartilham dessa origem ectomesenquimal, juntamente com a participação do epitélio odontogênico, é possível que possuam similaridades com os mixomas odontogênicos em sua patogênese molecular. Este estudo objetivou investigar o padrão de expressão do gene PRKAR1A na odontogênese murina e humana, além de investigar a ocorrência de alterações moleculares deste gene nos FA, FDA, FOA e FSA. Investigamos ainda, se camundongos Prkar1a+/- desenvolvem tumores odontogênicos. Para o estudo da odontogênese, embriões humanos e de camundongos em diferentes estágios do desenvolvimento foram processados para análise de expressão do RNAm do PRKAR1A/Prkar1a e PRKAR2A/Prkar2a por hibridização in situ whole-mount e radioativa. Expressão dos transcritos dos genes foi também verificada por qRT-PCR em germe dentário humano. Para investigar as alterações moleculares do PRKAR1A nos tumores odontogênicos, foram utilizadas 13 amostras de TOM e as técnicas de qRT-PCR, imunoistoquímica, perda de heterozigosidade (LOH) e sequenciamento direto. Os TOM foram microdissecados e o componente epitelial foi separado do mesenquimal por microdissecção à laser em 7/13 casos. Cabeças de camundongos Prkar1a+/- foram incluídas em parafina e coradas por HE. Os genes das subunidades R1 e R2 mostraram expressão nos germes dentários de murinos e humanos nas fases da odontogênese avaliadas por hibridização in situ ou qRT-PCR. A análise dos tumores odontogênicos mostrou um decréscimo significativo nos níveis de expressão do RNAm de PRKAR1A em comparação à mucosa oral normal, enquanto que a expressão de PRKAR2A não mostrou diferença entre os grupos. Os TOM exibiram também um padrão variável na imunoexpressão da PRKAR1A, apresentando perda de imunoexpressão em ambos os componentes do tumor e principalmente no ectomesênquima dos FA. Houve LOH na maior parte dos tumores avaliados, sendo que, em todos os tumores benignos que exibiram perda de imunoexpressão, observamos também LOH no lócus de PRKAR1A. Mutações ainda não descritas foram identificadas em quatro amostras, sendo uma missense, duas silenciosas, além de duas mutações em 5UTR e quatro mutações intrônicas. Os camundongos Prkar1a+/- não mostraram evidência de formação de tumor odontogênico. Conclui-se que os genes PRKAR1A/Prkar1a e PRKAR2A/Prkar2a estão expressos durante a odontogênese normal e que a expressão do PRKAR1A nos TOM está diminuída. A diminuição na expressão do RNAm e proteína do gene PRKAR1A ocorreu juntamente com LOH no lócus do gene. Embora a haploinsuficiência de Prkar1a em camundongo não tenha sido suficiente para causar tumores odontogênicos, alterações moleculares neste gene estão presentes nos TOM, participando da patogênese molecular destes tumores.Odontogenic tumours constitute a rare and heterogenous group which share similarities with the tooth germs. The tumors derived from odontogenic epithelium and odontogenic ectomesenchyme with or without hard tissue formation, were classified by the World Health Organization (WHO) as the mixed odontogenic tumours (MOT). Belong to this group of MOT, ameloblastic fibroma (AF), which is reported the malignant transformation of the ectomesenchymal counterpart into ameloblastic fibrosarcoma (AFS), besides ameloblastic fibrodentinoma (AFD) and ameloblastic fibroodontoma (AFO). cAMP-dependent protein kinase (PKA) is the main mediator of cAMP in mammalian cells, and is a tetramer composed of two regulatory subunits and two catalytic. From genes codifing PKA subunities, the only one associated with human neoplasias is PRKAR1A. PRKAR1A is a tumour-suppressor gene encoding PKA regulatory subunit 1 (R1). PRKAR1A is involved in the pathogenesis of odontogenic myxomas, an odontogenic tumour probably derived from the ectomesenchymal tissue, which revealed decreased PRKAR1A protein expression and mutations. As the MOT share this ectomesenchymal origin, together with the participation of the odontogenic epithelium, it is possible that these tumours share similarities with the odontogenic myxomas in their molecular pathogenesis. The aim of this study was to investigate the pattern of expression of PRKAR1A in murine and human odontogenesis as well as investigate the occurrence of molecular alterations of PRKAR1A in AF, AFO, AFD and AFS. We further investigated if Prkar1a+/- mice develop odontogenic tumours. To odontogenesis investigation, mouse and human embryos of different stages of development were processed to analysis of PRKAR1A/Prkar1a and PRKAR2A/Prkar2a mRNA expression by wholemount in situ and radioactive in situ hybridization. The expression of human genes transcripts were also verified by qRT-PCR in human dental germ. To investigate the PRKAR1A molecular alterations in odontogenic tumours, 13 samples of TOM were assessed by qRT-PCR, immunohistochemistry, LOH analysis and direct sequencing. The MOT were laser microdissected and the epithelial component was separated from the mesenchymal part by laser microdissection in 7/13 of cases. Mice Prkar1a+/- heads were paraffin embedded and stained with HE. The genes of R1 and R2 subunits showed expression in stages of odontogenesis in murine and human tooth germs evaluated by in situ or qRT-PCR. The odontogenic tumours analysis demonstrated a significantly decreased PRKAR1A mRNA levels of expression comparing with normal oral mucosa, while the PRKAR2A expression did not show difference between groups. The MOT exhibited a variable imunoexpression pattern of PRKAR1A protein, demonstrating loss of imunoexpression in both components of tumour, mainly in the ectomesenchyme of AF. LOH was seen in most tumours evaluated, in which all benign tumours with loss of imunoexpression we still observed presence of LOH in PRKAR1A locus. Mutations underreported were identified in four samples, being one missense, two synonymous, besides two mutations in 5UTR and four intronic mutations. Prkar1a heterozygous mice did not show evidence of odontogenic tumour formation. We conclude PRKAR1A/Prkar1a and PRKAR2A/Prkar2a are expressed during odontogenesis and the expression of PRKAR1A is decreased in MOT. The decreased in expression of mRNA and protein of PRKAR1A gene occurred together with LOH in gene locus. Although Prkar1a haploinsufficiency in mouse has not been sufficient to cause odontogenic tumours, molecular alterations in PRKAR1A are present in MOT, participating of molecular pathogenesis of these tumours