Estudo do mecanismo de ação do peptídeo hipotensor TsHpt-I isolado da peçonha do escorpião Tityus serrulatus e de seus análogos estruturalmente minimizados

Peptídeos potenciadores de bradicinina (PPB) podem ser encontrados em diferentes fontes animais, e, do ponto de vista estrutural, estes peptídeos apresentam uma assinatura contendo um resíduo de ácido piroglutâmico no N-terminal e dois resíduos de prolina na porção C-terminal. O peptídeo TsHpt-I foi previamente isolado da peçonha do escorpião amarelo Tityus serrulatus e descrito como um PPB. Embora apresente o motivo estrutural Pro-Pro, este peptídeo não inibe a enzima conversora de angiotensina (ECA), como descrito para outros PPBs conhecidos, além de ser capaz tanto de potenciar a bradicinina quanto induzir uma rápida e transiente hipotensão in vivo em ratos normotensos.Para avaliar a possível participação de receptores de bradicinina na hipotensão mediada pelo TsHpt-I, células CHO transfectadas com os receptores de bradicinina e marcadas com DAF foram observadas por microscopia confocal perante o estímulo com TsHpt-I. Foi possível observar um aumento na fluorescência induzida pela produção de óxido nítrico em células estimuladas com BK (controle) e TsHpt-I. Análises de western blotting em células CHO-B2 mostraram a fosforilação da Ser1177, o resíduo excitatório da eNOS, na presença de BK e TsHpt-I, corroborando os resultados obtidos pela microscopia confocal.Em ensaio semelhante ao utilizado em células CHO-B2, a liberação de óxido nítrico foi avaliada em cardiomiócitos, que expressam constitutivamente os receptores de cininas. Nestas células, o peptídeo TsHpt-I, assim como a bradicinina, também induziram a liberação de NO, sendo este efeito abolido por HOE 140, um antagonista de B2R. Um análogo sintético estruturalmente minimizado, de apenas três aminoácidos (KPP), foi capaz de manter a atividade observada para o peptídeo integro. A acetilação da cadeia lateral da lisina (acKPP), aboliu a liberação de oxido nítrico, sugerindo que a carga positiva deste aminoácido seja essencial para o efeito agonista dos peptídeos no receptor. Ao estimular os cardiomiocitos com o análogo KPP na presença de HOE 140, a fluorescência também foi abolida, assim como observado para TsHpt-I. Em cardiomiocitos de animais duplo knockout para B1/B2, não houve liberação de NO nas presenças de BK, TsHpt-I e KPP. Neste experimento, somente o grupo controle positivo (Ang(1-7)) aumentou a fluorescência.Os resultados sugerem a ativação direta de B2R como o modo de ação primário de TsHpt-I, sendo que o peptídeo análogo, de apenas três aminoácidos, é capaz de manter este efeito. Foi ainda observado que a carga positiva da cadeia lateral da lisina é essencial para esta atividade.Bradykinin Potentiating Peptides (BPPs) can be found in different animal sources and, from the structural point of view, share a common signature with a Pyroglutamic acid residue in the N-terminus and a doublet Pro-Pro residues at the C-terminal portion. TsHpt-I, is a peptide isolated from the yellow scorpion Tityus serrulatus venom that, although sharing the Pro-Pro motif, do not exhibit the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibition, as described to other known BPPs, although it is able both to potentiate bradykinin and to induce a fast and transient in vivo hypotension in normotensive rats. To better evaluate the observed hypotensive effect of TsHpt-I, CHO cells transfected with the bradykinin receptors were used to observe, by confocal microscopy, a fluorescence induced by nitric oxide production in stimulated cells by BK and TsHpt-I. Western Blot analyses in CHO B2 cells showed the phosphorilation of Ser 1177 residue, the excitatory site of eNOS, in presence of the BK and TsHpt-I, corroborating the confocal results. In a similar assay used for CHOB2 cells, the nitric oxide was measured in cardiomyocytes that express constitutively the BK receptors. In these cells, TsHpt-I, likewise BK, was able to induce the release of nitric oxide. This effect was abolished by HOE 140, an antagonist of the B2R. Synthetic minimized analogue from C-terminal portion of TsHpt-I, with only three aminoacids residues (KPP), was also able to keep the activity observed for the whole peptide. When KPP was acetylated at the lysine side-chain, the nitric oxide production was abolished, suggesting that the positive charge is essential for the bradykinin receptors agonism. The use of KPP in cardiomyocytes in presence of HOE 140, has abolished the fluorescence, as for TsHpt-I. In cardiomyocytes from double knockout mice for B1/B2, BK, TsHpt-I and KPP were not able to induce nitric oxide release. In this assay only the positive control group (Ang(1-7)) showed fluorescence.These results suggest the direct activation of BKR as a primary mode of action for TsHpt-I and the analog peptide bearing only three aminoacids (KPP). Also it was evidenced that the positive charge of the lysine is crucial for this activity