Clonagem e expressão do gene da toxina épsilon de clostridium perfringens tipo D e sua aplicação na imunização de animais

A toxina épsilon é produzida pelo Clostridium perfringens tipos B ou D, sendo responsável pela enterotoxemia em ovinos, caprinos e bovinos. A doença é de caráter agudo ou super agudo, causando morte súbita e grandes perdas econômicas. A evolução da doença dificulta qualquer medida terapêutica, e o processo pode ser prevenido através de imunizações com vacinas comprovadamente eficientes. O gene etx, que codifica a toxina épsilon, foi clonado no plasmídeo TOPO TA e subclonado em pET-11a, utilizando a linhagem de Escherichia coli BL21 (DE3), para a expressão do gene da toxina épsilon de C. perfringens tipo D. A toxina épsilon recombinante foi expressa, principalmente, na forma insolúvel, retida em corpos de inclusão, e, a dosagem, realizada por SDS-PAGE comparativamente com quantidades conhecidas de BSA, foi estimada em 10 mg/mL, com título em camundongo (M. musculus) de 25 x 102 DL50/mL. Os resultados foram confirmados pelo teste de soroproteção e soroneutralização cruzada em camundongos (M. musculus). Coelhos foram imunizados com 200, 100 e 50 µg da fração insolúvel da proteína recombinante, para o teste de potência, utilizando suspensão de hidróxido de alumínio como adjuvante, obtendo títulos de 40, 30 e 10 UI/mL, respectivamente. Esses valores foram superiores aos níveis de 5 UI/mL, exigido pela Farmacopéia Européia (1998), e, 2 UI/mL, exigido pelo Code of Federal Regulation/USA. A toxina épsilon recombinante produzida neste trabalho mostrou-se uma forte candidata para a produção de uma vacina contra enterotoxemia causada pela toxina épsilon de C. perfringens tipo DThe epsilon toxin is produced by Clostridium perfringens types B and D, causing enterotoxaemia in sheep, goats and calves. Enterotoxaemia is a disease with acute or super-acute profile, causing sudden death and huge economic loss. The therapeutic intervention may be difficult since the disease evolution is very rapid. However, this process can be prevented by immunizations with specific immunogenic vaccines. In the present work the etx gene encoding the epsilon toxin was cloned into pET-11a and the recombinant epsilon toxin was expressed as inclusion bodies. The protein concentration was determined and the lethal doses (LD) were estimated in mice, reaching 25 x 102 LD50/mL. Serum protection and cross-serum neutralization tests in mice were also used to characterize the recombinant toxin. For potency test, rabbits were immunized with 200, 100 and 50 µg of recombinant toxin, using aluminum hydroxide gel as adjuvant. Obtained titers of 40, 30 and 10 UI/mL, respectively, were higher than the minimum level of 5 UI/mL required by the European Pharmacopoeia (1998) and the minimum level of 2 UI/mL required by the Code of Federal Regulation/USA. The recombinant epsilon toxin produced emerges as a strong candidate for the production of a vaccine against enterotoxaemia caused by epsilon toxin of C. perfringens type