Avaliação do efeito de duas linhagens de Lactococcus lactis na ancilostomose experimental

A ancilostomose é uma doença tropical negligenciada que acomete cerca de 740 milhões de pessoas no mundo, sendo a principal causa de anemia em crianças e gestantes. Organismos probióticos atuam no trato gastrointestinal modulando a resposta imune de forma direta ou induzindo a tolerância oral a antígenos. A Hsp65 é uma proteína muito presente em ambientes inflamados, sendo inibida por células TREG específicas. Essa molécula vem sendo utilizada para induzir a expansão deste tipo celular e conferir um ambiente menos propenso a inflamação em doenças com a colite ulcerativa e a doença de Crohn. Neste trabalho, foi avaliado o efeito do uso de duas linhagens de Lactococcus lactis subsp lactis NCDO2118 na ancilostomose experimental, por duas abordagens distintas, usando protocolo para avaliar o feito da tolerância oral à Hsp65 (experimento I) e a modulação direta pelo L. lactis lactis NCDO2118 (experimento II) ambos em hamster (Mesocricetus auratus) infectados com Ancylostoma ceylanicum. No experimento I, os animais foram divididos em seis grupos: não tratado e não infectado (NT + NI), não tratado e infectado (NT + I), tratado com meio M17 e infectado (T + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 selvagem e infectado (NCDO + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 contendo o plasmídeo vazio (pXylT:SEC:nuc) e infectado (NCDO R + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 expressando Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) e infectado (Hsp65 + I). O tratamento foi realizado durante quatros dias, com administração da cultura ad libitum e após intervalo de sete dias, infecção com 50 larvas por via oral (gavagem). Esta infecção foi acompanhada durante 30 dias através da aferição de peso, hemograma, proteínas totais no soro e ovos por grama de fezes (O.P.G.). No dia da eutanásia foi realizada a recuperação de vermes adultos do intestino delgado e linfonodo mesentérico. Neste experimento não foi observado diferença entre os tratamentos nos parâmetros avaliados, não permitindo inferir que foi estabelecida a tolerância oral e que ela interferiu no curso da infecção. No experimento II, os animais foram divididos em grupos: não tratado e infectado (NT + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 selvagem iniciado com zero dia de infecção (NCDO 0), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 expressando Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) iniciado com zero dia de infecção (HSP65 0), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 selvagem iniciado aos oito dias de infecção (NCDO 8) e tratado com L. lactis lactis NCDO2118 expressando Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) iniciado aos oito dias de infecção (HSP65 8). Os tratamentos foram administrados durante quatro dias ad libitum. A infecção com 50 larvas infectantes ocorreu no dia zero em todos os grupos. A Infecção foi acompanhada por 30 dias e foram avaliados os parâmetros descritos anteriormente. Os grupos que foram tratados no dia zero da infecção apresentaram carga parasitária inferior aos demais grupos, interferindo nos demais parâmetros. Os grupos tratados com oito dias de infecção apresentaram uma carga parasitária maior que o controle, com seus parâmetros também sendo alterados em função disso. Este trabalho mostra que o protocolo utilizado para a indução da tolerância oral a Hsp65 não foi efetivo na ancilostomose, porém, a utilização de L. lactis lactis NCDO2118 pode interferir na carga parasitária do hospedeiro.Ancylostomiasis is a neglected tropical disease that affects about 740 million people worldwide and is the leading cause of anemia in children and pregnant women. Probiotic organisms, such Lactococcus lactis subsp lactis NCDO2118, act in the gastrointestinal tract by modulating the immune response directly or inducing oral tolerance to antigens. The HSP65 protein is highly present in inflamed environments being inhibited by specific TREG cells. This molecule has been used to induce growth of this cell type and to create an environment less susceptible to inflammation in diseases as ulcerative colitis and Crohn's disease. This study evaluated the effect of using L. lactis subsp lactis NCDO2118 in experimental ancylostomiasis, by two different approaches, using a protocol to assess the effect of oral tolerance to Hsp65 (experiment I) and by direct modulation of L. lactis lactis NCDO2118 (experiment II) both in hamster (Mesocricetus auratus) infected with Ancylostoma ceylanicum. In the first experiment, the animals were divided into six groups: untreated and uninfected (NT + NI), untreated and infected (NT + I), treated with M17 medium and infected (T + I), wild L. lactis lactis NCDO2118 and infected (NCDO + I), L. lactis lactis NCDO2118 (pXylT:SEC:nuc) and infected (NCDO R + I), L. lactis lactis NCDO2118 expressing Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) and infected (HSP65 + I). Treatment was conducted over four days, with the culture administrated to the animals ad libitum. After seven days, animals were orally infected with 50 larvae (via gavage). This infection was monitored for 30 days by measuring, the animals weight; blood cells; total protein in serum and eggs per gram of feces (O.P.G.). On the day of euthanasia adult worms were recovered from the small intestine and mesenteric lymph node kept to later detection of cytokines. In this experiment, no difference was observed among treatments in the evaluated parameters, not allowing to infer that oral tolerance has been established and that it interfered with the course of infection. In the second experiment, the animals were divided into groups: untreated and infected (NT + I) treated with wild L. lactis lactis NCDO2118 initiated with zero days of infection (NCDO - 0), treated with L. lactis lactis NCDO2118 expressing Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) started with zero day infection (HSP65 - 0) treated with wild L. lactis initiated at eight days of infection (NCDO - 8) and treated with L. lactis lactis expressing Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) initiated at eight days of infection (HSP65 - 8). Treatments were administered for four days ad libitum. All groups were infected with 50 larvae on day zero. The infection was monitored for 30 days and the same parameters described above, were evaluated. The groups that were treated on day zero of infection showed a lower parasite load than the other groups, interfering with the other parameters evaluated. The groups treated with eight days of infection showed a higher parasite load compared to the control group with the related parameters also being changed accordingly. This study shows that the protocol used for the induction of Hsp65 oral tolerance was ineffective in ancylostomiasis, however, the use of L. lactis lactis NCDO2118 can interfere with parasite load in the host