Dinâmica e mecanismo de ação de metaloenzimas envolvidas na hidrólise de compostos organofosforados

A presente Tese de Doutorado envolveu o estudo teórico da dinâmica e reatividade de metaloenzimas envolvidas na degradação de compostos organofosfatos. Em particular, a degradação do triester de fosfato paraoxon pela enzima fosfotriesterase. Inicialmente a hidrólise não enzimática do paraoxon em solução aquosa foi estudada onde se obteve, diferente hidrólise alcalina, que a hidrólise neutra ocorre em duas etapas, através de um mecanismo AN + DN, com a formação de um intermediário pentacoordenado de fósforo. A reação apresenta energias livres de ativação de 31,8 e 1,9 kcalmol-1 para a primeira e segunda etapas, respectivamente, prossegue através de uma sequência de processos de transferência de prótons a partir da molécula de água nucleofílica e terminando com a protonação do grupo de saída nitrofenolato. A inclusão explícita das moléculas de água de solvatação mostrou-se essencial para descrever os processos de transferência de prótons ao longo da coordenada de reação e também para estabilizar o intermediário pentacoordenado. A hidrólise do paraoxon também foi estudada utilizando um modelo do sítio ativo da enzima fosfotriesterase de Pseudomonas diminuta contendo íons Cd2+. A partir deste estudo foi proposto um mecanismo básico consistindo em: i) Troca da molécula de água coordenada e coordenação do substrato ao átomo de Cdß mais exposto ao solvente de forma monodentada, ii) protonação do ligante em ponte µ-hidroxo pela molécula de água e formação in situ do nucleófilo, iii) formação de um intermediário pentacoordenato com quebra de ligação química do grupo de saída e formação de ligação química para com o nucleófilo, iv) protonação do resíduo de aminoácido Asp301 e restauração do sítio ativo através da coordenação de outra molécula de água do meio solvente. Foi mostrado que as moléculas de água inicialmente coordenadas no sítio ativo desempenham um papel crucial na estabilização dos estados de transição e do intermediário pentacoordenado. A reação ocorre através de um mecanismo de duas etapas (AN + DN), com barreiras de energia de 12,9 e 1,9 kcalmol-1 para a primeira e segunda etapas, respectivamente, em excelente concordância com os dados experimentais. Para os sistemas enzimáticos estudados, a inclusão da energia de dispersão contribui para diminuir as barreiras de energia em até 26%. O mecanismo básico para a anzima Cd2+/Cd2+ de PTE proposto mostrou ser uma proposta consistente mecanisticamente e viável cineticamente. Os efeitos dos diferentes cofatores metálicos presentes no sítio ativo da enzima fosfotriesterase de Pseudomonas diminuta foram avaliados através de simulações de dinâmica molecular clássica. O modelo de íon livre e modelo de íon ligado com parametrização de potencial foram utilizados para a descrição dos metais de transição e parametrização do campo de força. As simulações da apoenzima de fosfotriesterase, em relação aos sistemas de Zn(II)-Zn(II) e Zn(II)- Cd(II), mostrou que a simples mudança de um dos metais no sítio ativo, através das análises de RMSF e PCA já são suficientes para provocar e mostrar modificações de dinâmica nas protéinas. Realizou-se simulações envolvendo o inibidor dietil metilbenzil fosfato e o substrato dietil p-nitrofenol fosfato nos sistemas parametrizados de Zn(II)-Zn(II) e Cd(II)-Cd(II). Através dos resultados foi mostrado que o inibidor dietil metilbenzil fosfato desloca-se do sítio ativo e fica durante a maior parte da simulação de dinâmica molecular clássica interagindo com resíduos de aminoácidos da superfície da enzima e com o meio solvente em ambos os sistemas. Entretanto, para o sustrato dietil p-nitrofenol fosfato percebemos uma modificação estrutural e reorientação do substrato ao mudar sua posição no sítio ativo. Os resultados obtidos nas simulações de PTE indicam que os dados correlacionados na literatura trazem informações que podem não ser adequadas em virtude: i) das formas de equilibração de energia do sistema enzimático de PTE; ii) e do espaço de tempo curto das simulações realizadas. Os estudos de dinâmica molecular mostraram que mudanças nos cofatores metálicos levam a mudanças expressivas na dinâmica das metaloenzimas e, portanto, afetam na reatividade enzimática.The present PhD thesis involved the theoretical study of the dynamics and reactivity of metalloenzymes involved in the degradation of organophosphate compounds. In particular, the degradation of the phosphate triester paraoxon by the phosphotriesterase enzyme. Initially the nonenzymatic hydrolysis of paraoxon in aqueous solution was studied where it was obtained that, different alkaline hydrolysis, neutral hydrolysis occurs in two stages, through an AN + DN mechanism, with the formation of a pentacoordenado phosphorus intermediate. The reaction exhibits activation free energies of 31.8 and 1.9 kcalmol-1 for the first and second stages, respectively, proceeding through a sequence of proton transfer processes from the nucleophilic water molecule and ending with protonation of the nitrophenolate leaving group. The explicitinclusion of solvation water molecules was essential to describe the proton transfer processes along the reaction coordinate and also to stabilize the pentacoordenated intermediate. The hydrolysis ofparaoxon was also studied using an active site model of the enzyme phosphotriesterase of Pseudomonas diminuta containing Cd2+ ions. From this study a basic mechanism was proposed consisting of: i) Co-ordinate water molecule change and coordination of the substrate to the Cd atom most exposed to the solvent in a monodentate way, ii) protonation of the -hydroxyl bridge ligand by the water molecule and in situ formation of the nucleophile, iii) formation of a pentacoordenate intermediate with significant breaking of chemical bonding of the leaving group and formation of chemical attachment to the nucleophile, iv) protonation of the amino acid residue Asp301 and restoration of the active site by coordination of another water molecule of the solventmedium. It has been shown that the water molecules initially coordinated at the active site play a crucial role in the stabilization of the transition states and the pentacoordinate intermediate. The reaction takes place through a two-step mechanism (AN + DN), with energy barriers of 12.9 and 1.9 kcal mol-1 for the first and second steps, respectively, in excellent agreement with the experimental data. For the enzymatic systems studied, the inclusion of dispersion energy contributes to decreaseenergy barriers by up to 26%. The basic mechanism for the proposed PTE Cd2+/Cd2+ enzyme proved to be a mechanistically consistent and kinetically feasible proposal. The effects of the different metallic cofactors present in the active site of the phosphotriesterase enzyme ofPseudomonas diminuta were evaluated through simulations of Classical Molecular Dynamics. The free ion model and ion model connected with potential parameterization were used for the description of transition metals and parameterization of the force field. The phosphotriesteraseapoenzyme simulations, in relation to the Zn(II)-Zn(II) and Zn(II)-Cd(II) systems, showed that the simple change of one of the metals in the active site, through the RMSF and PCA are already sufficient to provoke and show changes of dynamics in the proteins. Simulations involving thediethyl methylbenzyl phosphate inhibitor and the diethyl p-nitrophenol phosphate substrate were carried out in the Zn(II)-Zn(II) and Cd(II)-Cd(II) parametrized systems. From the results it has been shown that the diethyl methylbenzyl phosphate inhibitor moves from the active site and remains for most of the classical molecular dynamics simulation interacting with amino acid residues from the surface of the enzyme and with the solvent medium in both systems. However, for the substratediethyl p-nitrophenol phosphate we noticed a structural modification and reorientation of the substrate by changing its position in the active site. The results obtained in the PTE simulations indicate that the correlated data in the literature provide information that may not be adequate dueto: i) the energy equilibration of the PTE enzyme system; ii) and the short time of the simulations. Molecular dynamics studies have shown that changes in metal cofactors lead to significant changes in the dynamics of metalloenzymes and therefore affect enzymatic reactivity