Avaliação e padronização de metodologias para análise da translocação cromossômica t(11;18)(q21;q21) em portadores de linfoma MALT gástrico

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-12T00:42:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_def_2013.pdf: 3858264 bytes, checksum: 5dae4cfbf0a50a70766bfd89e770f919 (MD5) Previous issue date: 13Os linfomas constituem um grupo heterogêneo de neoplasias malignas que se originam nas células do sistema linfático, divididos em dois grandes grupos: os linfomas de Hodgkin e linfomas não-Hodgkin (LNH). Considerando o local de origem, podem ser classificados como nodais ou extranodais, sendo os extranodais originados em qualquer órgão contendo tecido linfoide associado à mucosa (MALT), também conhecidos como linfoma de zona marginal tipo células B. Os LNHs extranodais compõem até 1/3 dos linfomas em geral, o trato gastrointestinal é o local de mais alta incidência, sendo o estômago responsável por 60% dos casos. Os linfomas gástricos compreendem 2 a 8% das neoplasias gástricas, são as mais frequentes depois do adenocarcinoma (90 a 95%). A mucosa gástrica normal não possui tecido linfoide, porém estudos demonstraram que infecções por Helicobacter pylori (H. pylori) estimulam o desenvolvimento de agregados linfoides em 27,4 a 100% dos indivíduos infectados, o que pode dar origem ao linfoma MALT gástrico (LMG). Pacientes com LMG apresentam H. pylori em 85 a 92% dos casos. Estudos in vitro evidenciaram a proliferação de LMG de baixo grau de células B ao estímulo por cepas específicas de H. pylori. Pesquisas correlacionando essa infecção com o LMG apontaram que a erradicação do microrganismo induz a completa remissão em 70 a 80% das lesões precoces de LMG, entretanto, aproximadamente 25% desses casos não respondem à erradicação do H. pylori. A translocação cromossômica t(11;18)(q21;q21), encontrada em uma significativa porcentagem de LMG de baixo grau, demonstra condicionar a independência das células do linfoma ao estímulo antigênico, com a consequente não regressão do linfoma após erradicação do H. pylori. Essa translocação genética representa o rearranjo mais comum associado ao LMG. Este estudo objetivou implementar metodologias para detecção e análise da translocação t(11;18) em portadores de LMG a partir das técnicas de transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e hibridização in situ fluorescente (FISH). As amostras de tecido fresco foram coletadas e armazenadas em RNAlater. O RNA foi extraído com reagente Trizol e tratado com desoxirribonuclease previamente à síntese do ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) por transcrição reversa e PCR usando primers específicos para API2-MALT1. A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 2%. Identificou-se a translocação em 50% (4/8) dos casos; outros 3/8 revelaram ausência do rearranjo e evolução clínica com remissão completa do LMG após erradicação do microrganismo, condizente com o achado e com os estudos descritos ao longo do trabalho; um caso foi identificado como de alto grau também não portador da mutação. FISH foi executada para amostras em parafina empregando sonda para API2-MALT1, porém ainda não foi possível a completa padronização. Os resultados até o momento indicam a hibridização da sonda fluorescente à outras estruturas celulares que não a área de interesse e mais estudos deverão ser realizados. Embora pequena a amostra, foi possível aimplementação de uma metodologia rotineira para identificação dessa mutação. Os resultados indicaram que a t(11;18) pode estar realmente relacionada à independência do LMG à erradicação do H. pylori. Estudos adicionais com um maior numero de pacientes e caracterização por sequenciamento dos transcritos de fusão encontrados colaborarão paramelhor compreensão de cada tipo de transcrito e esclarecimentos quanto à sua patogenicidade. O estudo molecular é essencial para identificação e diferenciação dessa alteração genética para intervir de forma terapêutica mais precoce e beneficiar a população brasileira carente de estudos moleculares sobre o LMG.Lymphomas are a heterogeneous group of malignancies that originate in the cells of the lymphatic system, divided into two major groups: Hodgkin's and non-Hodgkin lymphomas (NHL). Considering the place of origin, it can be classified as nodal or extranodal, being the extranodal originated in any organ containing the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT), also known as marginal zone lymphoma of B cell type. The NHLs extranodal comprise up to 1/3 of lymphomas in general, the gastrointestinal tract is the site of highest incidence being the stomach responsible for 60% of cases. Gastric lymphomas comprise 2 to 8% of gastric tumors and are the most frequent after adenocarcinoma (90 to 95%). The gastric mucosa has no lymphoid tissue, but studies have shown that infection by Helicobacter pylori (H. pylori) stimulates the development of lymphoid aggregates in 27.4 to 100% of infected individuals, which may lead to gastric MALT lymphoma (GML). GML patients present H. pylori in 85 to 92% of cases. In vitro studies demonstrated the GML low-grade B-cell proliferation by stimulation of specific strains of H. pylori. Studies correlating this infection with GML showed that eradication of the microorganism induces complete remission in 70 to 80% of premature lesions of GML, however, approximately 25% of these cases do not respond to eradication of H. pylori. The chromosomal translocation t(11;18)(q21,q21), found in a significant percentage of low-grade GML, demonstrates conditional independence of lymphoma cells to antigenic stimulus, with consequent non-regression of lymphoma after eradication of H. pylori. This translocation gene represents the most common rearrangement associated with the GML. This study aimed to implement methodologies for detection and analysis of the t(11;18) in patients with GML from techniques of reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR)and fluorescent in situ hybridization (FISH). The fresh tissue samples were collected and stored in RNAlater. The RNA was extracted with Trizol, and treated with deoxyribonuclease prior to synthesis of the complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) by reverse transcription and PCR using specific primers for API2-MALT1. Electrophoresis was performed in 2% agarose gel. The translocation was identified in 50% (4/8) of cases, other 3/8 revealed the absence of the rearrangement and clinical complete remission of GML after the microorganism eradication, consistent with the finding and the studies described over the work; one case was identified as high-grade also not carrying the mutation. FISH was performed for paraffin samples using API2-MALT1 probe, but it was not possible to complete standardization. The results obtained so far indicate that the fluorescent probe is hybridizing other cell structures than the area of interest and further studies should be undertaken. Despite the small sample, it was possible to implement a methodology for routine identification of this mutation. The results indicated that t(11,18) might be related to the independence of the GML to the eradication of H. pylori.Additional studies with a larger number of patients and characterization by sequencing of the fusion transcripts found will contribute to better understanding of each type of transcript and elucidation regarding its pathogenicity. The molecular analysis is essential for identification and differentiation of this genetic rearrangement to intervene in early therapeutic way and benefit the Brazilian population that lacks GML molecular studies