Aplicação clínica do sequenciamento e análise bioinformática de exomas

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-11T23:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_natalia_linhares.pdf: 4564641 bytes, checksum: cbc49e5ad0700131e070576136e35636 (MD5) Previous issue date: 16Aproximadamente 7.000 doenças mendelianas já foram descritas, porém menos da metade delas foi relacionada com mutações em genes específicos. No presente trabalho, realizamos a análise bioinformática de exomas de pacientes com doenças mendelianas raras, atendidos no Hospital das Clínicas da UFMG ou no Laboratório Gene Núcleo de Genética Médica, com o objetivo de localizar variantes que pudessem estar causalmente relacionadas com as doenças. Foi realizado um estudo embasado na análise de exomas, tendo como foco duas aplicações clínicas distintas: (1) aprimoramento da correlação genótipo-fenótipo em cromossomopatias através do estudo de um paciente com microdeleção no cromossomo 1p13.2; (2) estudo de doenças mendelianas de causa pouco esclarecida; neste, analisamos duas famílias com miofibromatose infantil e dois pacientes com calcificações no cérebro e convulsões. No primeiro caso, avaliamos o fenótipo de pacientes com microdeleções em 1p13.2 e observamos que muitos apresentavam características de síndrome de Noonan. A região deletada em comum entre todos os pacientes contém o gene NRAS, e mutações de ganho de função nesse gene foram descritas em casos de síndrome de Noonan tipo 6. Realizamos, então, a análise de sequenciamento do exoma do nosso paciente para examinar a possibilidade de variantes patogênicas recessivas desmascaradas pela deleção hemizigota e também para verificar se o paciente tinha alguma variante patogênica nos genes relacionados com a síndrome de Noonan. Concluímos que o fenótipo dos pacientes pode ser relacionado causalmente com a deleção do gene NRAS. Então, havia o paradoxo de que haploinsuficiência de NRAS poderia causar características similares a mutações de ganho de função. Uma situação similar foi descrita para a síndrome de Noonan com ganho de função e haploinsuficiência do gene SHOC2 e também para a síndrome cardio-facio-cutânea, na qual o fenótipo da doença pode aparecer tanto em razão de deleções de MAP2K2 quanto de mutações de ganho de função. Concluímos, assim, que a desregulação da via Ras/MAPK causada tanto por mutação de ganho de função como por haploinsuficiência pode resultar em fenótipos similares. Realizamos também a análise de exomas, a fim de estudar doenças mendelianas de causa pouco esclarecida; para tal, analisamos duas famílias com miofibromatose infantil (MI), desordem rara, de patogênese molecular pouco conhecida, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores benignos na pele, no músculo, nos ossos e nas vísceras. Neste estudo, realizamos inicialmente a análise dos exomas de dois irmãos diagnosticados com MI multicêntrica visceral e dos seus pais saudáveis e consanguíneos. Identificamos uma variante homozigota no gene NDRG4 nos dois irmãos. Coerentemente com o fenótipo de MI, NDRG4 é um gene relacionado com o desenvolvimento de tumores. Desse modo, sugerimos que a variante em NDRG4 pode ser a variante causal na família estudada com MI autossômica recessiva. Para confirmar nossos achados, pesquisamos na literatura por famílias com MI com herança possivelmente autossômica recessiva. Estudamos, então, uma família francesa com dois irmãos afetados com pais saudáveis e não consanguíneos. Identificamos, porém, nos dois irmãos, uma variante heterozigota no gene PDGFRB. Variantes nesse gene foram relacionadas com a forma autossômica dominante de MI. Para nossa surpresa, a mãe dos pacientes também apresentava a mesma variante em PDGFRB. Constatamos que ambos os irmãos herdaram paternalmente uma variante heterozigota em PTPRG, uma enzima que sabidamente desfosforila PDGFRB, reduzindo sua atividade. Sugerimos, então, que variantes em PTPRG podem explicar a penetrância fenotípica completa nos irmãos afetados. Portanto, propusemos que a variante em NDRG4 deve ser investigada em outras famílias com MI autossômica recessiva e que variantes no gene PDGFRB estão relacionadas apenas com a forma autossômica dominante da doença. Além disso, estudamos dois pacientes com microcefalia, convulsões e calcificações no tegmento pontino do cérebro, desordem rara com etiologia pouco conhecida. Suspeitamos de variantes provavelmente patogênicas em quatro genes candidatos: CCBE1, ARL5B, RSU1 e CRLS1. Todavia, pela técnica de sequenciamento de Sanger, verificamos que tais variantes eram erros de leitura do sequenciamento do exoma. Realizamos, então, nova análise dos exomas, procurando por genes que sabidamente causassem epilepsia. Encontramos, por meio dessa análise, variantes candidatas nos genes SCN1A e CHD2. Mutações heterozigotas nesses genes foram causalmente relacionadas com síndrome de Dravet, caracterizada por crises de convulsões com início no primeiro ano de vida. Porém, estas variantes também não foram confirmadas pela técnica de sequenciamento de Sanger. Análises futuras serão então necessárias para identificar novos genes candidatos. Concluindo, com o presente trabalho verificamos que a análise de exomas pode melhorar a qualidade de correlações genótipo-fenótipo de síndromes causadas por anormalidades cromossômicas, bem como auxiliar na detecção de genes que, quando mutados, podem ser causadores de doenças genéticas. Os resultados encontrados contribuíram para o melhor entendimento das doenças genéticas estudadas, auxiliando, desse modo, no diagnóstico de pacientes futuros e contribuindo para o acompanhamento e o aconselhamento genético dos pacientes e de seus familiares.Approximately 7,000 Mendelian diseases are described, but less than half of these disorders were associated with mutations in specific genes. In this work we performed bioinformatics analysis of exomes from patients with rare Mendelian diseases, treated at the Hospital das Clínicas da UFMG or Laboratório Gene Núcleo de Genética Médica, aiming to find variants that may be causally associated with the diseases. We conducted a study grounded in exome analysis, which has focused in two distinct clinical applications: (1) to improve the genotype-phenotype correlation in chromosomal disorders, by studying a patient with chromosome 1p13.2 microdeletion; (2) to study Mendelian diseases with undefined cause; we analyzed two families with infantile myofibromatosis and two patients with brain calcifications and seizures. In the first case we evaluated the phenotype of patients with 1p13.2 microdeletions and we found that they had many features of Noonan Syndrome. The overlap deletion region of all the patients contained the NRAS gene, gain-of-function mutations of which have been described as causing Noonan Syndrome, Type 6. We performed thus exome sequencing analysis in our patient in order to examine the possibility of a recessive pathogenic variant unmasked by his hemizygous deletion and also to verify if he had pathogenic variants in any of the Noonan Syndrome genes. We concluded that their phenotype may be causally related to deletion of NRAS. Thus, we have the paradox that NRAS haploinsufficiency appears to be able to cause similar characteristics to gain-of-function mutations. Similar situation have been described for Noonan syndrome with gain-of-function mutations and haploinsufficiency of the SHOC2 gene and also for the related Cardio-facio-cutaneous syndrome, in which signs of the disease can appear due to both MAP2K2 deletions and gain-of-function mutations. Consequently we concluded that dysregulation of the Ras/MAPK pathway caused either by gain-of-function mutations or haploinsufficiency may result in similar phenotypes. We also performed exome analysis to study Mendelian diseases with poorly defined cause, for this we analyzed two families with infantile myofibromatosis (MI), which is a rare disorder, with molecular pathogenesis poorly understood, characterized by the development of benign tumors in the skin, muscle, bones and viscera. In this study, we analyzed firstly the exomes of two brothers diagnosed with visceral multicentric IM, and of its healthy and consanguineous parents. We identified a homozygous variant in the gene NDRG4 in the two brothers. Consistent with the IM phenotype, NDRG4 is a tumor-related gene. Thus, we suggested that the variant in NDRG4 may be the causal variant in the studied family with autosomal recessive IM. To confirm our findings, we surveyed the literature for IM families with inheritance possibly autosomal recessive. Then we studied a French family with two affected siblings of healthy and not consanguineous parents. However, we identified in the two brothers a heterozygous variant in the gene PDGFRB. Variants in this gene have been associated with autosomal dominant form of IM. To our surprise, the mother of the patients also had the same variant in PDGFRB. We also found that both brothers inherited paternally a heterozygous variant in PTPRG, an enzyme known to dephosphorylate PDGFRB, reducing its activity. Then we suggested that variants in PTPRG may explain the full phenotypic penetrance in the affected siblings. Therefore, we propose that the variant in NDRG4 should be investigated in other families with autosomal recessive IM, and variants in the gene PDGFRB are associated only with the autosomal dominant form of the disease. In addition, we studied two patients with microcephaly, seizures and calcifications in pontine tegmentum of the brain, which is a rare disorder with poorly understood etiology. We suspected of probably pathogenic variants in four candidate genes: CCBE1, ARL5B, RSU1 and CRLS1. However, by Sanger sequencing technique, we found that such variants were exome sequencing errors. We performed then new analysis of the exomes, looking for genes that are known to cause epilepsy. Doing this analysis we found candidate variants in SCN1A and CHD2. Heterozygous mutations in these genes have been causally related to Dravet syndrome, characterized by seizures with onset in the first year of life. Nevertheless, these variants were also not confirmed by Sanger sequencing. Future analyzes will then be required to identify novel candidate genes. In conclusion, with this study we verified that exome analysis can improve the quality of genotype-phenotype correlations of syndromes caused by chromosomal abnormalities and can assist in the detection of genes that, when mutated, may cause genetic diseases. Our results contributed to a better understanding of the studied genetic diseases, supporting, thus, the diagnosis of future patients and contributing to the monitoring and genetic counseling of patients and their families