Estudos sobre os mecanismos de recombinação em trypanosoma cruzi: obtenção e análise de células superexpressando o gene TcRaD51

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-11T18:36:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_final.pdf: 1340454 bytes, checksum: 42e0a1bbb636a0894af903e0dcdb9e11 (MD5) Previous issue date: 10Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. Somente poucos genes envolvidos no metabolismo de DNA foram descritos nessa espécie. Recentemente, nosso grupo caracterizou em T. cruzi, o gene codificador para uma das principais proteínas envolvidas na recombinação homóloga, a proteína TcRad51. Visando entender melhor o papel de Rad51 em processos de recombinação nesse parasita, esse gene foi superexpresso no clone CL Brener de T. cruzi. Após a verificação da superexpressão do mRNA de TcRad51 nas culturas transfectadas através da técnica de northern blot, esses parasitos foram submetidos a agentes que causam quebras de fita dupla, tais como a radiação gama e a droga zeocina. Foi observado que a superexpressão de TcRad51 aumenta a resistência a esses agentes. Além disso, foi verificado que esse aumento corresponde a uma cinética de recuperação mais rápida do DNA fragmentado nos parasitos transfectados, observada através de eletroforese em campo pulsátil. Além do seu papel no reparo de quebra de fita dupla, o envolvimento do gene TcRad51 no processo de recombinação foi avaliado em ensaios de transfecção e integração de fragmentos exógenos no genoma do parasita. Parasitos selvagens e superexpressando TcRad51 foram transfectados com plasmídeo contendo o gene de resistência ao antibiótico G418 e da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) e sequências homólogas ao gene de tubulina. Verificou-se que a superexpressão de TcRad51 resulta em aumento do número de clones resistentes a G418 e capazes de expressar GFP, os quais, provavelmente, tiveram o plasmídeo integrado no locus de tubulina. Nós também obtivemos clones derivados de culturas transfectadas superexpressando TcRad51. Os clones apresentaram níveis variáveis de expressão de TcRad51, mas não demonstraram diferenças em seu crescimento quando comparados com a população transfectada e as células selvagens. Novas análises com esses clones deverão contribuir para investigar melhor a importância de Rad51 na manutenção da estabilidade genômica desse parasita e no metabolismo de DNA em T. cruziTrypanosoma cruzi is the parasite that causes Chagas disease. Only a few genes involved in DNA metabolism have been described in this species. Recently, our group characterized a gene encoding one of the key proteins involved in homologous recombination in T. cruzi, TcRad51. To better understand this process, we over-expressed TcRad51 in the CL Brener strain of T. cruzi. Northern blot assays showed an increase in mRNA levels of TcRad51 in the population of transfected cells as well as in cloned transfected cell lines. When we submitted these cells to agents that cause double strand DNA breaks, such as gamma radiation and Zeocin, we observed that cells over-expressing TcRad51 show an increased resistance to both agents. In addition, using pulse field gel electroforesis (PFGE), we observed a difference in the level of fragmentation of genomic DNA after exposition to gamma radiation, with the kinetics of chromosomal reconstitution being faster in transfected cells than in wild type cells. These results indicate TcRad51 has a role in the maintenance of genomic stability in this parasite, and participates in the process of double strand break repair after exposure to genotoxic agents. In addition, we also investigate the involvement of TcRad51 in gene targeting by homologous recombination. Wild type parasites and cells over-expressing TcRad51 were transfected with plasmids containing a drug resistance gene, the GFP gene and sequences homologous to tubulin. It was observed that cells over-expressing TcRad51 shows an increase in the number of clones resistant to G418 and GFP positive, which have probably the plasmid integrated into the tubulin locus. We also obtained clones derived from transfected cultures over-expressing TcRad51. The clones show similar growth when compared with the transfected population and wild type cells but show variable levels of TcRad51 mRNA expression. Further analysis using these clones will allow us to better understand the role of the TcRad51 gene in the T. cruzi DNA metabolis