Genotipagem de Mycobacterium bovis pelo multispacer sequence typing

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-10T20:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_formatada__rica_bravo_sales.pdf: 1252334 bytes, checksum: f0545b7d76ec640554b0e53ef0c66852 (MD5) Previous issue date: 2O Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, está entre as espécies pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis. A doença causada pelo bacilo bovino constitui um grave problema devido aos prejuízos diretos causados por esta enfermidade e possíveis barreiras sanitárias na exportação. O genoma do M. bovis é >99,95% geneticamente idêntico ao de M. tuberculosis, dificultando o diagnóstico. A tipificação molecular permite inovar a identificação de uma espécie e ao mesmo tempo gerar genótipos mediante a combinação de diferentes marcadores polimórficos, contribuindo para a sua investigação epidemiológica. As técnicas mais utilizadas atualmente para tipificar o patógeno M. bovis são o Spoligotyping e o VNTR, no entanto, esses métodos não são capazes de reconhecer toda a diversidade genética dos isolados analisados como é o caso de métodos baseados em sequenciamento, que permitem a análise de sequências alvos moleculares, identificando dessa forma todos os eventos genéticos presentes no marcador utilizado. O objetivo deste trabalho foi tipificar isolados de Mycobacterium bovis pela técnica Multispacer Sequence Typing (MST). Sete regiões espaçadoras intergênicas foram analisadas para um total de 58 isolados de M. bovis relativos aos anos de 2006 a 2010, procedentes de fazendas localizadas em seis estados brasileiros (MG, GO, SP, MT, PR. RS) e para quatro amostras padrão de M. bovis. Quatro tipos de eventos genéticos foram observados: mutação de nucleotídeo único (SNP), inserção, deleção e repetição em tandem (TR), totalizando a partir da combinação dos genótipos obtidos um total de 28 eventos. Os resultados, obtidos pela comparação in silico entre os fragmentos gerados pelo sequenciamento e a cepa padrão M. bovis AF2122/97 [Genbank BX248333.1] permitiu identificar 28 perfis genotípicos únicos, caracterizando 28 sequências tipo (ST) na amostragem analisada e apontando um índice de discriminação de 93%. Esses dados foram utilizados para analisar os padrões de descendência evolutiva dos isolados de M. bovis e correlacioná-los a linhagens filogeográficas com base na formação de complexos clonais gerados a partir do eBURST. Este foi o primeiro trabalho a identificar a variabilidade dos isolados de M. bovis pelo método MST. Os resultados obtidos foram bastante satisfatórios, dado que o método permitiu tipificar e diferenciar isolados de M. bovis a partir do sequenciamento de poucas regiões espaçadoras, mesmo em localizações restritas e em um período de tempo curto como foi verificado no município de Bueno Brandão. O método apresenta a vantagem do sequenciamento e a disponibilização de sequências analisadas em bancos de dados públicos, que podem ser utilizadas por profissionais em todo o mundo como ferramenta para análises futuras.Mycobacterium bovis, which causes bovine tuberculosis, is a species belonging to Mycobacterium tuberculosis complex. It shows 99.9% of genetic homology with other species of the complex, making the diagnosis difficult. The bovine bacilli represent a serious problem due to the direct losses in cattle, caused by such infirmity and possible sanitary barriers to exportation. Molecular typing, provide an innovative way to identify bacterial strains, trough generate while genotypes by combining different polymorphic DNA markers, contributing to their epidemiological investigation. The techniques currently used for typing of M. bovis are Spoligotyping and VNTR. However these methods are not able to recognize all genetics analyzed strains diversity such as sequencing methods based in last ones allow analyzing molecular target sequence, thereby identifying all events present in the genetic marker used. This paper aims standardize Multispacer Sequence Typing (MST) for M.bovis genotyping. Seven intergenic spacer region were analyzed on 58 M.bovis samples, coming from six brazilian's states (MG, GO, SP, MT, PR, RS), isolated between 2006 and 2010, and on four M.boviss reference strains. Four types of genetic events were observed: nucleotide mutation (SNP), insertion, deletion and tandem repeat (TR), totaling from the combination of genotypes obtained a total of 28 events. Twenty-eight type sequences (TS) have been also produced, showing a discrimination index of 93%, including the standard strain AF2122/97 [Genbank BX248333.1] used for comparison in silico. These data were used to analyze the pattern of evolutionary lineage of M. boviss isolates and correlate them with phylogeographic lineages, based on the formation of clonal complexes, generated from eBURST. This is the first study aimed identify the variability of isolates of M. bovis using MST method. Results were quite satisfactory. Method allowed us to typing and differentiate M.bovis isolate from a sequencing of few regions, even in restricted locations and in short a time as established in Bueno Brandao city.The method has the sequencing advantage and the availability of sequences analyzed in public databases which can be used by professionals around the world as an analyzes tool