Análise óptica da junção neuromuscular de diafragma em modelo de camundongo transgênico para doença de Huntington

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-10T16:37:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_barbara_corrigida_p_sdefesa_pdf.pdf: 1476642 bytes, checksum: 89788d5f4029ec61da17030bc0897389 (MD5) Previous issue date: 1A doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por um declínio progressivo das funções motoras e cognitivas, incluindo movimentos involuntários dos membros e da face, alterações de personalidade e demência. Ela é causada pela repetição do trinucleotídeo CAG que leva a uma expansão poliglutamínica da proteína huntingtina. Sabe-se que huntingtina é altamente expressa nos sistemas nervoso central e periférico. No interior dos neurônios, esta proteína se liga a vesículas sinápticas e interage com várias proteínas associadas ao transporte vesicular. Assim, sugere-se que a huntingtina mutante pode interferir com a liberação de neurotransmissores causando disfunção sináptica, o que pode agravar a deficiência motora característica da doença. Dados anteriores indicam uma redução da neurotransmissão colinérgica em neurônios do Sistema Nervoso Central, bem como comprometimento motor em modelos animais para DH. Baseado nestas evidências, este estudo tem como objetivo principal avaliar as possíveis alterações na junção neuromuscular do músculo diafragma de camundongos BACHDQ97, modelo transgênico para DH, cuja progressão da doença é mais lenta quando comparada às linhagens previamente estabelecidas. Esse modelo representa um novo e robusto paradigma in vivo para estudar a patogênese da DH. Resumidamente, para análise óptica, as preparações nervo ciático-músculo diafragma foram isoladas e coradas com a sonda vital FM1-43 (4M) e -bungarotoxina-Alexa 594 (12 M) para visualizar terminais pré-sinápticos e aglomerados de receptores nicotínicos, respectivamente. A sonda FM1-43 é uma ferramenta útil para se acompanhar exocitose, endocitose e reciclagem de vesículas sinápticas. Utilizando a microscopia de fluorescência e confocal foram realizadas análises de parâmetros morfológicos em animais BACHDQ97 e WT. Nós observamos que os elementos pré e pós-sinápticos de animais BACHDQ97 apresentaram-se menos fluorescentes quando comparados aos de animais WT. Vimos também que a taxa de desmarcação/exocitose dos terminais previamente marcados com o FM1-43 foi menor nos animais transgênicos. Além disso, estudos ultraestruturais foram realizados utilizando a técnica de microscopia eletrônica de transmissão (MET), para caracterizar o aspecto morfológico das sinapses neuromusculares nestes animais. Vimos que os elementos sinápticos das junções neuromusculares de camundongos BACHDQ97 apresentaram morfologia ultraestrutural geral semelhante aos dos animais WT. Nossos resultados indicam uma deficiência funcional de elementos pré e pós-sinápticos que podem afetar a função motora em animais BACHDQ97.The Huntingtons disease (HD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive decline of motor and cognitive functions including involuntary movements of the limbs and face, personality changes and dementia. It is caused by a CAG trinucleotide repetition that leads to a polyglutamine expansion in the huntingtin protein. It is known that huntingtin is highly expressed in the central and peripheral nervous systems. Within neurons, this protein binds to synaptic vesicles and interacts with several proteins associated with vesicular transport. Thus, it is suggested that the mutant huntingtin may interfere with the release of neurotransmitters causing synaptic dysfunction, which may lead to motor impairment characteristic of the disease. Previous data indicate a reduction in cholinergic neurotransmission, as well as motor impairment in animal models of HD. Based on this evidence, this study aims to assess the possible changes in the neuromuscular junction of diaphragm muscle of mice BACHDQ97, a transgenic model for HD, which disease progression is slower when compared to other previously established strains. This model represents a new and robust in vivo paradigm for studying the pathogenesis of HD. Briefly, for optical analysis, neuromuscular preparations were isolated and stained with the dye FM1-43fx (4 M) and -bungarotoxin-Alexa 594 (12 M) to visualize presynaptic terminals and acetylcholine receptors clusters, respectively. The styryl dye FM1-43 is a powerful tool to track exocytosis, endocytosis and recycling of synaptic vesicles. Through confocal and fluorescence microscopy, morphological parameters were analyzed in BACHDQ97 and WT animals. We observed that pre and post-synaptic elements presented less fluorescent in BACHDQ97 animals when compared to WT. We also notice that in the nerve terminals previously labeled with FM1-43 the destaining/excocytosis rates were lower in the transgenic animals. Moreover, ultrastructural studies were performed using electron microscopy transmission (TEM) technique to characterize the morphological aspect of neuromuscular synapses in these animals. Concerning the TEM, we saw that the synpatic elements of the neuromuscular junctions in BACHDQ97 mice show ultrastructural morphology resembling the WT animals. Thereby, our evidences suggest a quantitative and functional impairment of BACHDQ97 mice presynaptic elements what might affect motor function