Mapeamento dos paratopos do anticorpo monoclonal Li mAb(7) anti-proteína dermonecrótica do veneno da aranha Loxosceles intermedia

O veneno da aranha Loxosceles intermedia contém proteínas com atividade de esfingomielinase (Smase D), principal componente dermonecrótico, responsável pelas preponderantes características do loxoscelismo cutâneo e cutâneo visceral como: a dermonecrose e insuficiência renal aguda. A partir da imunização de camundongos com o veneno bruto da aranha Loxosceles intermedia, nosso grupo obteve o anticorpo monoclonal Li mAb(7), que demonstrou ser capaz de neutralizar a atividade dermonecrótica do veneno da L. intermedia numa relação dose-dependente; 50 g de Li mAb(7) neutralizou significativamente 10 g de veneno bruto e, portanto possui alto potencial para ser utilizado na terapia antiveneno. Além disso, o Li mAb(7) não possui reatividade cruzada com venenos de Loxosceles laeta (Brasil), L. laeta (Peru) e Loxosceles gaucho. Visando a obtenção de peptídeos com elevado potencial neutralizante dos efeitos tóxicos da L. intermedia, capazes de superar dificuldades na produção de soros, como a obtenção do veneno e a reprodutibilidade inter e intraindividual da atividade neutralizante do soro, este estudo se dedicou ao mapeamento dos paratopos do Li mAb(7). Utilizando ferramentas de bioinformática e a metodologia Spot Synthesis, as regiões determinantes de complementariedade foram identificadas, peptídeos em membrana de celulose foram sintetizados a partir da análise estrutural da interação antígeno-anticorpo e os aminoácidos essenciais para o reconhecimento da proteína com atividade de esfingomielinase e suas localizações foram mapeadas. Na sequência, peptídeos solúveis foram produzidos. Por ensaio de ELISA sanduíche foi demonstrado que os peptídeos se ligam, de uma maneira específica e dose-dependente, ao mesmo epitopo conformacional reconhecido pelo Li mAb(7). No entanto, o ensaio de ELISA por competição não confirmou a disputa entre os peptídeos solúveis (607 e 642) e o anticorpo monoclonal pelo mesmo sítio de ligação. Tampouco a capacidade neutralizante da atividade de esfingomielinase foi demonstrada. Assim, demonstrou-se que os peptídeos solúveis originados do mapeamento do Li mAb(7), reconhecem especificamente o mesmo epitopo e por ferramentas de bioinformática possuem estrutura conformacional semelhante a região Fv do anticorpo.The venom of the spider Loxosceles intermedia contains proteins with sphingomyelinase activity (SMase D), the main dermonecrotic component responsible for the prevalent symptoms of cutaneous and cutaneous visceral loxoscelism like dermonecrosis and acute renal failure. After the immunization of mice with crude venom of Loxosceles intermedia spider, our group obtained the monoclonal antibody Li mAb(7), which has been shown to neutralize the dermonecrotic activity from the venom of L. intermedia in a dose-dependent relationship, 50 ug Li mAb(7) neutralized 10 g of crude venom, and therefore has high potential for use in anti-venom therapy. In addition, the monoclonal antibody Li mAb(7) showed no cross-reactivity with venoms of Loxosceles laeta (Brazil), L. laeta (Perú) and Loxosceles gaucho. In order to obtain peptides with high potential neutralizing the toxic effects of L. intermedia, which are able to overcome difficulties in the production of sera, like the poison obtainment and the maintenance of serum neutralization capacity, this study was dedicated to the mapping of paratope of Li mAb(7). Using on bioinformatics tools and Spot Synthesis methodology the complementarity determining regions were identified, peptides on cellulose membrane were synthesized from structural analyzes of antigen-antibody interactions and the essential amino acids residues for recognition of the protein with sphingomyelinase activity and their locations have been mapped. The soluble peptides were produced and sandwich ELISA assay demonstrated that peptides bind in a specific and dose-dependent manner, the same conformational epitope recognized by Li mAb(7). Competition ELISA assay did not confirm the competition for the same binding site between soluble peptides (607 and 642) and monoclonal, however, it is believed that due to high affinity of antibody for the epitope. Neither the neutralizing capacity of sphingomyelinase activity was demonstrated. Thus, it was demonstrated that peptides derived from the soluble mapping Li mAb(7) specifically recognize the same epitope and have a conformational structure similar to the Fv region of the antibody