Identificação e caracterização do exoproteoma de duas linhagens de Corynebacterium pseudotuberculosis através das técnicas de 2D-DIGE e espectrometria de massa

A Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa, doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes. Os principais fatores de virulência desta bactéria são a exotoxina fosfolipase D e lipídios tóxicos da parede celular. Estudos demonstraram que proteínas extracelulares são importantes para: aquisição de nutrientes, interação com hospedeiro, sobrevivência da bactéria em diversos ambientes e por tanto representam alvos para a produção de vacinas de métodos de diagnóstico. Os genomas das linhagens 1002 e C231 de C. pseudotuberculosis isoladas de caprino do Brasil e de ovino da Austrália respectivamente foram seqüenciados e predições in silico geraram uma lista destas proteínas com suas prováveis funções. Neste trabalho, através de abordagens proteômicas, foi realizada uma analise comparativa entre proteínas extracelulares das duas linhagens para gerar mapas proteícos, avaliar a diferença de expressão e validar os resultados preditos in silico. As amostras protéicas foram obtidas através da técnica de fracionamento em três fases. Para estudar a diferença de expressão foi utilizada a técnica de 2D-DIGE que após a análise por espectrometria de massa resultou na caracterização de 10 proteínas, 5 na linhagem 1002 e 5 na linhagem C231, relacionadas a fatores de virulência, resposta a estresse, componentes estruturais e funções desconhecidas. Através da associação 2-DE/MALDI-TOF MS/MS foi possível gerar mapas protéicos e caracterizar 55 e 45 proteínas extracelulares das linhagens 1002 e C231 respectivamente. A união dos dados obtidos neste trabalho com os resultados obtidos Pacheco et al. (2011), possibilitou caracterizar experimentalmente 104 proteínas do exoproteoma de C. pseudotuberculosis. Este estudo demonstrou que, mesmo sendo bactérias da mesma espécie, há diferenças de expressão e a presença de proteínas específicas para cada linhagem, estando estas relacionadas a fatores de virulência e fisiologia celular que podem influenciar no mecanismo de infecção e adaptação ao hospedeiro, favorecendo a progressão e instalação da doença. Além disso, este trabalho abre perspectivas para estudos específicos com as proteínas identificadas, para possível aplicação no desenvolvimento de métodos de diagnóstico e vacinas.Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous lymphadenitis - a chronic infectious disease that affects small ruminants. The main virulence factors of this bacterium are exotoxin phospholipase D and toxic lipid on cell wall. Studies have shown that extracellular proteins are important for: nutrient acquisition, interaction with the host, survival of bacteria in different environments and targets for vaccine production and methods for diagnosis. The genomes of strains 1002 and C231 of C. pseudotuberculosis isolated from Brazil goat and sheep and from Australia, respectively, were sequenced and a list of the aforementioned proteins with their likely functions was generated by in silico predictions. In the advent of this work, a comparative analysis was performed between two strains of extracellular proteins for characterization, assessment of difference in expression and validation of the results predicted in silico using proteomic approaches. The protein samples were obtained by fractionation technique in three phases. To study the difference in expression, 2D-DIGE technique was used. After analysis by mass spectrometry resulted in the characterization of 10 proteins (5 from 1002 and 5 from strain C231 strain), related to virulence factors, stress response, structural components and unknown functions. Through the association of 2-DE/MALDI-TOF MS/MS it became posible to generate maps and characterize 55 and 45 extracellular proteins of strains 1002 and C231 respectively. The union of the present data with those obtained Pacheco et al. (2011), allowed experimentally characterized 104 proteins from the exoproteoma of the C. pseudotuberculosis. This work portrays the fact that even though the bacteria of the same species, there exist differences in expression and presence of specific proteins in each strain, as they are related to virulence factors and cellular physiology that may influence the mechanism of infection and adaptation to the host, which contribute to the progression and onset of illness. Furthermore, this work opens perspectives for specific studies of the proteins identified for possible application in the development of diagnostic methods and vaccine