Avaliação das características fenotípicas e funcionais de monócitos humanos durante a infecção por Leishmania e submetidos a tratamento com drogas leishmanicidas convencionais e alternativas

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-10T02:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.erica.2012.corrigida.pdf: 5946074 bytes, checksum: ffe4d89d89c8704951f96b1c73527838 (MD5) Previous issue date: 10A leishmaniose é uma doença endêmica causada pela infecção por diferentes protozoários do gênero Leishmania, afetando milhões de pessoas em todo o mundo. Os monócitos/macrófagos desempenham um importante papel na proteção do hospedeiro contra as infecções por serem capazes de fagocitar e gerar moléculas tóxicas como óxido nítrico (NO) no combate ao parasito. Os receptores do tipo Toll (TLR) possuem um papel essencial na resposta imune contra infecções, mas, pouco se sabe sobre seu papel na infecção humana por Leishmania braziliensis. A busca por novas abordagens quimioterápicas é uma necessidade para o controle e tratamento da leishmaniose. Neste contexto, o estudo de moléculas imunomoduladoras e de compostos naturais com potencial adjuvante ao tratamento convencional desponta como uma importante estratégia. Produtos naturais conhecidos como extratos de plantas medicinais são popularmente utilizados como medicamentos desde tempos antigos. Dentre esses, encontram-se as naftoquinonas obtidas das plantas da família Biognoniaceae, abundante em várias espécies e muitas nativas no Brasil. Esses extratos de plantas já foram estudados em diversas doenças, apresentando atividade antimicrobiana comprovada, além da ação antinflamatória e antineoplásica. Outro composto estudado por suas diversas ações no sistema imunológico foi a N-acetilcisteína (NAC), precursora da glutationa. Sua ação tem sido avaliada na fibrose cística, aterosclerose, infecções por HIV e em diferentes tipos de cânceres. Estudos prévios demonstraram feito da NAC na leishmaniose, em que a sua administração via oral em camundongos infectados por L. major reduziu a lesão cutânea e o parasitismo. Neste trabalho, investigou-se a expressão de TLR9 em células mononucleares do sangue periférico (CMSP), bem como a expressão de moléculas co-estimuladoras e citocinas em monócitos CD14+ de pacientes com leishmaniose cutânea decorrente da infecção por L. braziliensis. Investigaram-se também possíveis candidatos terapêuticos ao tratamento da leishmaniose, como a naftoquinona denominada DT.15 e a NAC, em monócitos de CMSP de indivíduos saudáveis e infectados in vitro por diferentes espécies de Leishmania: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) infantum e Leishmania (Leishmania) major. Analisou-se a atividade leishmanicida desses compostos, assim como sua influência na expressão de marcadores de ativação, moléculas co-estimuladoras e na produção de citocinas. Os resultados demonstraram redução na frequência de CD80 e CD86, e aumento na frequência de CD16 nos monócitos de pacientes com leishmaniose cutânea em relação aos indivíduos não-infectados (NI). Em seguida, análises de correlações indicaram que as moléculas CD80 e CD40 correlacionaram-se positivamente entre si e com a produção de IL-12, no entanto, negativamente em relação a expressão de CD86. Encontrou-se também uma elevada produção de TNF e uma baixa expressão de IL-12 pelos monócitos dos pacientes com LC, quando comparados aos indivíduos NI. Com relação à expressão de TLR9, encontrou-se uma elevada expressão desse receptor quando as células dos pacientes foram submetidas a cultura com antígeno solúvel de Leishmania (SLA), e quando comparado com os indivíduos NI na presença do estímulo. De forma interessante, a expressão de TLR9 correlacionou-se positivamente com o tamanho da área da lesão nos pacientes. Esses achados sugerem que houve uma regulação negativa na expressão de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, existindo uma relação tênue entre esses marcadores. No entanto, houve aumento na expressão de TLR9, CD16 e TNF nos monócitos infectados, sugerindo uma imunomodulação dessas células com possíveis mecanismos compensatórios. Na segunda parte dessa tese, notou-se que as drogas DT.15 e NAC apresentaram atividade leishmanicida sobre diferentes espécies de Leishmania, principalmente no tratamento direto das culturas celulares desses parasitos. Demonstrou-se redução do número de parasitos, aumento da taxa de morte e inibição da proliferação celular em relação ao controle sem medicamento. Os resultados das drogas testes (DT.15 e NAC) foram semelhantes aos encontrados com as drogas de tratamento padrão (anfotericina B e Glucantime®). Nos monócitos provenientes de CMSP de indivíduos saudáveis, submetidas à infecção in vitro por diferentes espécies de Leishmania, os resultados encontrados não apresentaram diferenças expressivas como os visualizados nas culturas dos parasitos isolados. No entanto, observaram-se importantes alterações, como baixa citotoxicidade dos compostos testes em células humanas, alteração dos marcadores de ativação, especialmente CD11b, CD80 e CD86. Além disso, visualizou-se como as espécies de Leishmania apresentaram diferenças na expressão de marcadores de ativação e citocinas, bem como os tratamentos com as drogas padrões afetaram diferentemente estas espécies no modelo de infecção in vitro. Assim, os resultados deste estudo demonstraram uma caracterização dos monócitos dos indivíduos infectados em áreas endêmicas, como em modelos de infecção in vitro, sendo relevante uma vez que estas células podem desempenhar um importante papel durante a infecção. Além disso, os compostos avaliados (DT.15 e NAC), apresentaram potencial terapêutico tanto em culturas isoladas de Leishmania, quanto nas células infectadas in vitro. No entanto, novos estudos são necessários para determinar os mecanismos por de trás desses potenciais candidatos.Leishmaniasis is an endemic disease caused by infection with protozoa of the genus Leishmania, affecting millions of people worldwide. Monocytes/macrophages play an important role in host defense against infections by being able to phagocytose and generate toxic molecules such as nitric oxide (NO) in combating parasite. The Toll-like receptors (TLR) have an essential role in the immune response against infections, but little is known about their role in human infection with Leishmania braziliensis. The search for new chemotherapeutic approaches is a need for control and treatment of leishmaniasis. In this context, molecules and immunomodulatory natural compounds with an adjuvant potential to conventional therapy are emerging as an important strategy for new studies. Natural products known as herbal extracts are popularly used as medicine since ancient times. Among these, we have obtained naftoquininas of the family Biognoniaceae, abundant in many species and with some species native in Brazil. These plant extracts have been studied in various diseases, with proven antimicrobial activity, in addition to anti-inflammatory action and antineoplastic. Another compound studied for its various actions on the immune system was N-acetylcysteine (NAC), a copound capable of incrasing greatly intracelular glutathione. Its action has been assessed in cystic fibrosis, atherosclerosis, HIV infection and in different types of cancers. Previous studies demonstrated that oral treatment with NAC reduced skin lesion and parasitism in a murine model for cutaneous leishmaniasis, caused by L. major infection. In this work, we investigated costimulatory molecules, TLR9 and cytokine expression by CD14+ monocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMC), in patients with cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania braziliensis infection. We also investigated possible therapeutic candidates for leishmaniasis treatment, such as a naphthoquinone called DT.15 and NAC using monocytes from PBMC of healthy donors, and infected in vitro with L. (Viannia) braziliensis, Leishmania infantum and Leishmania major. We analyzed the leishmanicidal activity of these compounds, characterizing the expression of activation markers and cytokine production. The results concerning the PBMC of patients infected by L. braziliensis and residents in the endemic area of Corte de Pedra, demonstrated a reduction in the frequency of CD80 and CD86, and increased frequency of CD16, compared to non-infected individuals (NI) in different culture conditions. Additionally, correlation analysis indicated that CD80 and CD40 molecules were positively correlated with each other and the production of IL-12, however, negatively with CD86 expression. While evaluating these individuals, we found a high production of TNF and a low expression of IL-12 compared to NI individuals. TLR9 expression, were high in patients submitted to soluble Leishmania antigen (SLA) cultures, and when compared to individuals NI in the presence of the stimulus. Interestingly, the expression of TLR9 by monocytes correlates positively with the lesion size in the patients. These findings suggest that there was a negative regulation in the expression of costimulatory molecules CD80 and CD86, and a relationship exists between these markers. However, increased expression of TLR9, CD16 and TNF on infected monocytes, suggest an immunomodulatory compensatory mechanism. In the second part of this thesis, it was noted that the drugs DT.15 and NAC showed leishmanicidal activity on different strains of Leishmania, mainly in the direct treatment of these parasites. The results showed that the drugs reduced parasites numbers, increased the rate of death and inhibited parasite proliferation when compared to control media. The results of the test drugs (DT.15 and NAC) were similar to standard treatment with amphotericin B and Glucantime ®. In monocytes from healthy individuals infected in vitro by different strains of Leishmania, the results showed no significant differences as seen in the cultures of parasite isolates. How ever, there were important changes, such as low cytotoxicity of test compounds in human cells, changes in activation markers, especially CD11b, CD80 and CD86. In addition, different strains of Leishmania showed a distinct profile of cytokines and activation marker expression, as well as the treatments with conventional drugs in this in vitro model of infection. In conclusion, the results of this study demonstrated that monocytes play an important role in the course and development of human leishmaniasis, both in the characterization of infected individuals in endemic areas, as well as in vitro models of infection. Furthermore, the compounds evaluated (DT.15 and NAC) showed therapeutic potential on the Leishmania isolated cultures, as well as using in vitro infected cells. However, further studies are needed to determine the mechanisms behind these potential therapeutic candidates