Participação do ativador do plasminogênio do tipo uroquinase na migração de células inflamatórias

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-09T22:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_bruno_rocha_12_01_17.pdf: 4000757 bytes, checksum: 9a4a456ebab32d44f1fc75379fabb56a (MD5) Previous issue date: 1O plasminogênio (Plg) é um zimogênio que é clivado à plasmina (Pla) pelos ativadores do plasminogênio do tipo tissular (tPA) ou uroquinase (uPA). O sistema plasminogênio/plasmina (Plg/Pla) está associado a diversas atividades biológicas além da sua atividade primária, a dissolução dos coágulos de fibrina, incluindo migração celular e inflamação. Neste estudo foi investigada a capacidade do uPA de induzir migração celular in vitro, utilizando linhagens de fibroblastos (MEFs) e macrófagos murinos (RAW 264.7), e in vivo por meio da injeção de uPA na cavidade pleural de camundongos. Foram também avaliados os papéis da proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) ERK1/2, das proteínas de adesão focal FAK e Paxilina (Pax), da quimiocina CCL2 e seu receptor CCR2 neste processo. A utilização de animais BALB/C neste estudo foi aprovada pelo CEUA/UFMG, protocolo número 19/2011. Monocamadas de MEFs e RAW foram arranhadas e posteriormente tratadas com uPA (1µg/mL) por diferentes tempos ou pré-tratadas com U0126 (inibidor de MEK1/2) ou RS504393 (antagonista de CCR2). As células foram processadas para contagem da migração para a região da ranhura, Western Blot para análise da fosforilação de ERK1/2, FAK e Pax e ELISA para dosagem de CCL2. Camundongos BALB/c receberam injeção intrapleural de uPA (1µg) e as células presentes na cavidade pleural foram coletadas em diferentes tempos e processadas para contagem total e diferencial. O tratamento com uPA induziu migração de MEFs e RAW de forma dependente de MEK/ERK, CCL2/CCR2 e foi associado à fosforilação das cinases de adesão focal FAK e Pax. A injeção intrapleural de uPA em camundongos induziu um influxo de células mononucleares para a cavidade pleural, associado ao aumento da fosforilação de ERK1/2 e FAK e dos níveis de CCL2. O bloqueio de CCR2 impediu a migração leucocitária induzida por uPA. A análise, por citometria de fluxo, dos macrófagos recrutados após injeção de uPA demonstrou uma predominância de macrófagos M2. Em conclusão, uPA induziu a migração de macrófagos in vitro e in vivo e esses são de perfil M2.Plasminogen (plg) is a zymogen that is cleaved to plasmin (pla) by the tissue-type (tPA) or urokinase-type (uPA) activator. The classical function of the plg/pla system is the dissolution of fibrin clots, but it has also been shown to be important in other biological activities, such as cell recruitment and inflammation. This study investigated the uPA ability to induce cell migration in vitro, using fibroblasts (MEFs) and macrophages (RAW 264.7) cell lines, and in vivo by injecting uPA in the pleural cavity of mice. It also evaluated the role of the mitogen-activated protein kinase ERK1/2, the focal adhesion proteins FAK and Paxillin (Pax), the chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in the process, as well as the profile of recruited cells. MEFs and RAW monolayers were scratched and then treated with uPA (1ìg/ml) for different times or pre-treated with U0126 (a MEK1/2 inhibitor) or RS504393 (a CCR2 antagonist). Cells were processed to count the migration to the scratch region, to analyze the phosphorylation of ERK1/2, FAK and Pax by Western Blot and to measure CCL2 levels by ELISA. BALB/C mice received an intrapleural injection of uPA (1ìg) and the cells present in the cavity were harvested at different time points and processed for total and differential count. The uPA treatment induced MEF and RAW migration dependent on MEK/ERK, CCL2/CCR2 and associated with the phosphorylation of focal adhesion kinases FAK and Pax. The intrapleural injection of uPA induced a time-dependent influx of mononuclear cells into the mice pleural cavity associated with increased phosphorylation of ERK1/2, IB-á and FAK and raised CCL2 levels. Importantly, the inhibition of CCR2 abrogated uPA-induced leukocyte influx. Further investigation of the recruited leukocytes by using flow cytometry showed a predominance of macrophages from M2 profile. In conclusion, uPA induces migration of macrophages in vitro and in vivo e those are from M2 profile