Efeitos do envelhecimento na mucosa intestinal: indução e declínio da tolerância oral

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-09T19:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_formatada_correta.pdf: 1383013 bytes, checksum: 3f18e6fddb11b471c597624fa79142ca (MD5) Previous issue date: 18Está bem descrito que o envelhecimento está associado com o declínio da indução de tolerância oral, a qual é iniciada na superfície da mucosa intestinal. Camundongos se tornam menos susceptíveis com 24 semanas de idade e totalmente refratários à indução de tolerância com 70 semanas. Nesses camundongos idosos, somente um regime ótimo de administração oral como a ingestão voluntária, mas não a gavagem, é capaz de torná-los tolerantes ao antígeno ingerido. Assim, avaliamos o efeito do envelhecimento em células T e citocinas da mucosa intestinal comprovadamente envolvidos na indução de tolerância oral. A freqüência de populações de células intraepiteliais (IELs) com fenótipo regulador, como TCRgd+ e CD4+CD8aa mostraram-se reduzidas em animais de 24 meses de idade. A produção de TGF-b e IL-10 também se mostraram diminuídas no intestino delgado de camundongos idosos. No entanto, células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+LAP+ assim como células T ativadas CD4+CD44+ estavam aumentadas na mucosa de camundongos a partir do 6 meses de idade. Além disso, a expressão da molécula co-estimuladora CD86 em células dendríticas (DCs) encontrava-se aumentada em camundongos de 12 meses de idade e a capacidade de DCs de camundongos idosos em estimular a secreção de TGF-b e a diferenciação de células CD4+LAP+, em estudos de co-cultura, também estava diminuída. A redução na produção de citocinas e na freqüência de células T com fenótipo regulador pode estar envolvida no declínio da susceptibilidade à indução de tolerância oral que acompanha o envelhecimento. Entretanto, nem todos os elementos reguladores estavam reduzidos, células com fenótipo regulador CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+CD25+LAP+ apresentaram-se aumentadas, e podem ter um papel importante na manutenção da homeostase da mucosa intestinal durante o envelhecimento. Além do seu efeito sobre a indução de tolerância oral, é possível que o envelhecimento também afete o tempo de duração desse fenômeno. De acordo com alguns autores a tolerância oral é mantida por um período curto de 21 dias a 3 meses após a administração oral do antígeno. Trabalhos anteriores de nosso grupo mostraram, no entanto, que a tolerância oral pode ser mantida por até um ano e meio após o tratamento oral. Esses relatos contraditórios podem ser explicados pelos diferentes protocolos experimentais que foram utilizados. A principal diferença nos protocolos está relacionada à imunização com antígeno+adjuvante após o tratamento oral. Em geral, a imunização é utilizada para testar a indução da tolerância oral, mas esse evento inflamatório parece afetar sua manutenção. Neste trabalho, também avaliamos o papel dos eventos inflamatórios desencadeados pela imunização na indução e manutenção da tolerância oral. Para isto, camundongos BALB/c com idade de 8-12 semanas foram tratados por via oral por gavagem com 20mg de OVA e imunizados com OVA+Al(OH)3 i.p. A imunização primária variou de 7 a 180 dias após o tratamento oral e o desafio com OVA i.p. dado 14 dias. Alternativamente, os animais foram imunizados com OVA+Al(OH)3 i.p. 7 dias após o tratamento oral e o desafio com OVA i.p. variou de 14 a 360 dias após a imunização primária. Observamos que somente camundongos que receberam imunização primária até 90 dias após o tratamento oral foram capazes de manter a tolerância oral para todos os parâmetros avaliados. Entretanto, camundongos imunizados 7 dias após o tratamento oral mantiveram a tolerância oral por até um ano após a ingestão do antígeno. Esses resultados sugerem que a imunização com antígeno+adjuvante pode fortalecer a manutenção da tolerância oral. A injeção concomitante de antígeno e adjuvante assim como o sítio de imunização também se mostraram fatores importantes na manutenção da tolerância oral. Além disto, observamos um aumento na freqüência de células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+CD25+LAP+ em camundongos DO11.10 que contam com 85% de linfócitos T expressando TCR transgênico para OVA após o tratamento oral com o antígeno ovalbumina. Um aumento na frequência dessas células também pode ser visto em camundongos C57BL/6 Foxp3-GFP knockin após o tratamento oral com antígeno seguido por imunização com OVA+Al(OH)3. Quando avaliamos os possíveis mecanismos pelos quais o Al(OH)3 reforçou a manutenção da tolerância oral, observamos que nem a formação de depósitos de antígeno nem a liberação de ácido úrico se mostraram necessários. Concluímos que muitas alterações associadas ao envelhecimento ocorrem no tecido linfóide associado à mucosa. Muitas delas podem estar envolvidas na reduzida susceptibilidade à indução de tolerância oral e no declínio da mesma em camundongos idosos. Além disto, o intervalo entre o tratamento oral e a imunização com OVA+Al(OH)3, a presença concomitante do antígeno e do adjuvante e a via de imunização afetaram o tempo de manutenção da tolerância oral. O mecanismo pelo qual o adjuvante Al(OH)3 prolonga o estado de tolerância oral não foi determinado e mais estudos são necessários para se obter uma resposta.Aging is reported to be associated with a decline in oral tolerance induction, an immunological phenomenon initiated at the intestinal mucosal surface. Mice become less susceptible with 24 weeks of age and totally refractory with 70 weeks of age. At this age, they can still be rendered tolerant but only by a regimen of continuous feeding. Herein, we examined the effect of aging in T cells and cytokines at the intestinal mucosa that are described as involved in oral tolerance induction. Frequencies of regulatory-type IEL subsets TCRgd+ and CD8aa are lower in 24-month-old-mice. Production of TGF-b and IL-10 in the small intestine was also reduced during aging. However, mucosal CD4+CD25+Foxp3+ and CD4+LAP+ regulatory T cells increased in mice from 6 months of age. Activated CD4+CD44+ mucosal T cells also augmented. Moreover, the expression of costimulatory molecule CD86 in DCs was augmented and the ability of mucosal dendritic cells to stimulate TGF-b secretion and differentiation of CD4+LAP+ T cells in co-culture studies also declined in 12-month-old-mice. Reduction in these regulatory-type cytokines and T cells may help to explain the decline in susceptibility to oral induction during aging. However, not all mucosal regulatory elements are diminished; CD4+CD25+Foxp3+ as well as CD4+CD25+LAP+ regulatory T cells are augmented and they might play a critical role in maintaining mucosal homeostasis during aging. In addition to its effect in oral tolerance induction, it is possible that aging also affects the time length of this phenomenon. According to some authors, oral tolerance is kept for 21 days to 3 months after feeding. Previous studies by our group showed that oral tolerance can be maintained for a period of one and a half year after oral treatment. These contradictory reports can be explained by different experimental protocols that were used. The main difference in the protocols is related to immunization with antigen + adjuvant that is essential to reveal oral tolerance induction. Thus, we also studied the role of inflammatory events triggered by immunization in the oral tolerance induction and maintenance. For that, BALB/c mice at age of 8-12 weeks were treated orally with 20mg of OVA by gavage and immunized with OVA+Al(OH)3 i.p. Primary immunization varied from 7 to 180 days after oral treatment in mice immunized with OVA+Al(OH)3 and a booster was administered 14 days afterwards. Alternatively, primary immunization with OVA+Al(OH)3 was performed 7 days after oral treatment and booster with OVA varied from 14 to 360 days after primary immunization. We observed that only mice primary immunized up to 90 days after oral treatment were able to sustain oral tolerance to all evaluated parameters. However, mice immunized 7 days after oral treatment were able to keep oral tolerance up to one year after oral treatment. These results suggest that immunization with antigen + adjuvant can act strengthening oral tolerance maintenance. The concomitant injection of antigen and adjuvant and the site of immunization were also important for oral tolerance maintenance. In addition, there was an increase in the frequency of Tregs cells CD4+CD25+Foxp3+ and CD4+CD25+LAP+ in DO11.10 OVA transgenic TCR mice after antigen feeding. Moreover, in C57BL/6 and GFP Foxp3+ knockin mice an increase percentage of these could be seem after oral treatment with antigen followed by immunization with OVA+Al(OH)3. When we searched for the possible mechanism by which Al(OH)3 helps in oral tolerance maintenance neither antigen deposits nor uric acid seem to be necessary. We can conclude that many changes in the gut mucosal associated immune system occurs that can be involved in oral tolerance decline in aged mice. In addition, the interval between oral treatment and primary immunization with OVA+Al(OH)3, the concomitant presence of antigen and adjuvant and the site of injection all affect oral tolerance maintenance