Estudo da resposta inflamatória em pulmões de camundongos imunizados com Pb27r submetidos à infecção desafio por Paracoccidioides brasiliensis

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo dimórfico, agente etiológico de uma micose sistêmica denominada paracoccidioidomicose (PCM). Descrita em 1908 por Adolf Lutz, esta micose é uma doença endêmica rural e suburbana, prevalente nas áreas tropical e subtropical da América Latina, com 80% dos casos descritos no Brasil. A infecção pode ser adquirida por via respiratória, através da inalação de partículas infectantes ou esporos, produzidos pela forma micelial do fungo e transportados pelo ar. A infecção primária geralmente ocorre nos pulmões e pode levar à insuficiência pulmonar crônica, resultante do desenvolvimento de fibrose, que ocorre simultaneamente com o processo inflamatório, infiltração de leucócitos e processos crônicos granulomatosos. Entre os antígenos de P. brasiliensis, é de notável destaque a proteína Pb27, que é um antígeno amplamente estudado e que tem demonstrado grande potencial como indutor de resposta imune protetora, bem como, marcador para imunodiagnóstico da PCM. Neste trabalho, esse antígeno foi utilizado com o objetivo de determinar a resposta inflamatória pulmonar induzida pela imunização com a proteína Pb27r e pelo tratamento com o quimioterápico Fluconazol. Para tanto, animais foram imunizados com a proteína Pb27r e, posteriormente, infectados com células leveduriformes da cepa virulenta de P. brasiliensis PB18 e receberam tratamento quimioterápico após a infecção desafio. As unidades formadoras de colônia foram determinadas após 30 e 90 dias de infecção e em ambas a imunização mostrou efeito protetor. Além disso, foram determinados níveis de anticorpos produzidos pelos animais antes e durante a infecção, através de ensaios de ELISA. Colorações histológicas, como Hematoxilina/eosina e Tricrômico de Masson, foram utilizadas na classificação de infiltrados inflamatórios e na detecção de fibrose pulmonar. As técnicas de Imunohistoquímica e Western Blot, foram utilizadas de forma qualitativa e quantificativa, respectivamente, para a marcação das moléculas TLR2 e TLR4, CCR7, Caspase 3 ativa, VEGF e VEGFR-2 e na detecção de fibras de colágeno tipo I. Foram detectados, também, a partir da técnica de PCR em Tempo Real, os níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias e das enzimas eNOS e iNOS. A análise conjunta dos resultados obtidos mostrou que Pb27r agiu modulando positivamente os mecanismos de resposta inflamatória e, como consequência, induziu proteção aos animais imunizados. A imunização foi caaz de induzir maior proteção e restabelecer a homeostase pulmonar após a infecção desafio, além de influenciar ativamente a vascularização pulmonar, a produção de óxido nítrico pelas células endoteliais e impedir a exacerbação da resposta inflamatória e de fibrose pulmonar.Paracoccidioides brasiliensis is a thermal dimorphic fungus and known to be the etiologic agent of a systemic mycosis called paracoccidioidomycosis (PCM). Described in 1908 by Adolf Lutz, this mycosis is rural and sub urban endemic disease, prevalent in tropical and subtropical areas of Latin America, with 80% of cases reported in Brazil. The infection may be acquired by the respiratory route through inhalation of infecting particles or spores, produced by the fungus mycelial form and transported by air. Primary infection usually occurs in the lungs and may also lead to chronic pulmonary insufficiency, resulting from the fibrosis development, which occurs simultaneously with the inflammation and leukocyte infiltration. Among antigens of P. brasiliensis, is especially remarkable Pb27 protein, an antigen which is extensively studied and has shown significant potential to induce a protective immune response and as marker for immunodiagnosis of PCM. In this work, this antigen was used to determine the pulmonary inflammatory response induced by immunization with the protein Pb27r. To this end, animals were immunized with the protein Pb27r and subsequently infected with 3 x 105 yeast cells of the virulent strain of P brasiliensis (PB18) and received chemotherapeutic treatment 30 days after challenge infection. The UFCs were determined were determined 30 and 90 days after infection and in both the immunization had a protective effect. In addition, antibody levels produced by the animals before and during infection were determined by ELISA assays. Histological staining (He and Masson's trichrome), were used in the classification of inflammatory infiltrates and the detection of pulmonary fibrosis. The techniques of Immunohistochemistry and Western blot were used in a qualitative and quantificative form (respectively) for the marking of TLR2 and 4 receptors, chemokine receptor CCR7, active Caspase 3, VEGF and its receptor VEGFR-2 and for the detection of collagen fibers Type I. Levels of pro and anti-inflammatory cytokines and eNOS and iNOS enzymes were also detected using the technique of RT-PCR. The joint analysis of the results showed that the recombinant protein Pb27 acts positively modulating the mechanisms of inflammatory response and consequently induces protection of immunized individuals. The immunization has the ability to induce greater protection and restore pulmonary homeostasis after challenge infection and also actively restore the pulmonary vasculature, nitric oxide production by endothelial cells and prevent the exacerbation of inflammation and lung fibrosis