Avaliação da atividade antiangiogênica do peptídeo sintético análogo a lunasina e do inibidor bowman-birk em membrana coriolantóica de gallus domesticus.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-01-21T19:53:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5)Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-01-22T15:17:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5)Made available in DSpace on 2015-01-22T15:17:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) Previous issue date: 2014A angiogênese ou neovascularização é um processo que inclui a ativação, adesão, proliferação e transmigração de células a partir de vasos sanguíneos pré-existentes, formando novos vasos. Para que isso ocorra, as células endoteliais devem primeiramente escapar da sua localização estável, através da ruptura da membrana basal, mediada por serino proteases (SPs) e metaloproteases (MPs) e migrar em direção ao estímulo angiogênico. Neste sentido, o equilíbrio entre as proteases e seus inibidores endógenos é necessário para manter a homeostase celular e a angiogênese fisiológica. Os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir proteases tripsina-símile e quimotripsina-símile. Dotado de capacidade antitumoral essa molécula pode atuar inibindo proteases envolvidas na angiogênese. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido comprovada, tanto em preparações enriquecidas, o BBI concentrado (BBIC) quanto em preparações purificadas. Entretanto, essa atividade antitumoral pode estar relacionada à presença de outras substâncias em sua preparação. Mais recentemente a Lunasina tem sido apontada como o principal componente responsável por tal atividade. O mecanismo de ação proposto para a Lunasina está relacionado à capacidade de inibição da acetilação de histonas, regulando a desespiralização da cromatina e assim, inibindo a proliferação celular. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiangiogênico de ambas as substâncias tendo em vista a possibilidade de inibição de enzimas proteolíticas pelo BBI e a atividade antiproliferativa da Lunasina. A avaliação do potencial antiangiogênico foi realizada através do Ensaio em Membrana Corioalantóica (CAM) de Gallus domesticus. Para identificar as atividades biológicas dessas proteínas da soja e explorar os possíveis mecanismos relacionados à atividade antiangiogenica, o domínio ativo da Lunasina (PL22) foi sintetizado e testado no ensaio de CAM in vivo. Testamos ainda o BBI purificado a partir de sementes de soja e a associação de PL22 e BBI. O peptídeo PL22 e o BBI apresentaram atividade na redução de vasos sanguíneos, a partir da dose de 7000 pmol. A porcentagem de redução do número de bifurcações em relação ao controle foi de 18% para o BBI na dose de 70 pmol e de 31% para o peptídeo PL22 na mesma dose. Entretanto não foi verificado efeito cooperativo ou sinérgico na associação do peptídeo PL22 com o BBI. Não foram observadas variações na expressão dos marcadores conexina-43 e VEGF pela técnica de Western blotting, sugerindo esses marcadores não estão relacionados ao mecanismo de ação do BBI e PL22. Os resultados da análise corroboram as avaliações feitas pela contagem direta dos vasos em microscópio digital do ponto de vista do efeito antiangiogênico. Além disso, foi observada uma atividade antinflamatória pra ambas as subtâncias. A apreciação dos perfis eletroforéticos bidimensionais de extratos das membranas corioalantóicas tratadas com BBI e PL22 demonstram uma expressão de proteínas diferencial em relação ao controle que permitirá a identificação de possíveis marcadores visando esclarecer o mecanismo e confirmar molecularmente os efeitos constatados.Angiogenesis or neovascularization is a process, which includes activation, adhesion and transmigration of cells from pre-existing blood vessels, forming new blood vessels. For the process occur, endothelial cells must first escape from their stable location, through disruption of the basement membrane, mediated by serine proteases (SPs) and metalloproteases (MPs) and migrate toward the angiogenic stimulus. Accordingly, the balance between proteases and their endogenous inhibitors is necessary to maintain cellular homeostasis and physiological angiogenesis. Protease inhibitors Bowman- Birk type (BBI) are proteins characterized by the presence of two independent domains capable of inhibiting trypsin-like and chymotrypsin-like proteases. Endowed with antitumor capacity this molecule may act by inhibiting proteases involved in angiogenesis. The ability of BBI to prevent carcinogenesis has proved both in enriched preparations, BBI concentrate (BBIC) and in purified preparations. However, the antitumor activity could be related to the presence of other substances in its preparation. More recently, lunasin was identified as the main component responsible for this activity. The proposed mechanism of action for lunasin was related with the ability to inhibit histone acetylation, regulating the chromatin unfolding and thus inhibiting cell proliferation. This study aimed to evaluate the antiangiogenic potential of both substances in view of the possibility of inhibition of proteolytic enzymes by BBI and antiproliferative activity of lunasin. The assessment of antiangiogenic potential was performed using Chorioallantoic Membrane Assay (CAM) of Gallus domesticus. To identify the biological activities of these proteins in soy and explore the possible use in anti- angiogenic therapy, the active area of lunasin (PL22) was synthesized and tested in the CAM assay in vivo. BBI also was tested and purified from soybean seeds and the association of PL22 and BBI. The PL22 peptide and BBI showed activity in reducing blood vessels from the dose of 7000 pmol . The percentage of reduction in the number of bifurcations compared to control was 18% for the BBI at a dose of 70 pmol and 31 % for the PL22 peptide at the same dose. However, no cooperative or synergistic effect was observed in association with the peptide PL22 and BBI. No changes in the expression of markers connexin-43 and VEGF by Western blotting was observed, suggesting these markers are not related to the mechanism of action of BBI and PL22. The results of the analysis support the evaluation performed by direct counting of vessels in digital microscope view of the antiangiogenic effect. In addition, an anti-inflammatory activity for both subtances was observed. The assessment of the two-dimensional electrophoretic profiles of extracts of chorioallantoic membranes treated with BBI and PL22 showed a differential expression of proteins compared to control. These experiments represent an approach to identify markers and mechanisms related to the observed effect