Análise do perfil de expressão de subunidades constituintes do proteassoma 26s em fases larvais e adultas do Schistosoma mansoni.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-09-19T22:13:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnálisePerfilExpressão.pdf: 2789555 bytes, checksum: 3ca47b9100f7ac2ba4c0f11d49c5c832 (MD5)Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:23:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnálisePerfilExpressão.pdf: 2789555 bytes, checksum: 3ca47b9100f7ac2ba4c0f11d49c5c832 (MD5)Made available in DSpace on 2014-11-07T12:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnálisePerfilExpressão.pdf: 2789555 bytes, checksum: 3ca47b9100f7ac2ba4c0f11d49c5c832 (MD5) Previous issue date: 2013Análises pós genômicas têm propiciado avanços significativos sobre a biologia do parasito Schistosoma mansoni. Particularmente, experimentos de transcrissômica em larga escala apontaram genes essenciais, ligados a vias de degradação proteica intracelular, com expressão diferencial ao longo do ciclo de vida do parasito. Tais achados corroboram com as marcantes alterações fenotípicas observadas após a penetração no hospedeiro vertebrado e o extenso remodelamento corporal necessário para a instalação e maturação do verme adulto no sistema porta-hepático.A presente investigação objetivou determinar o perfil de expressão de subunidades constituintes do proteassoma 26S, em fases larvais e adultas do verme. Neste intuito, oligonucleotídeos específicos para amplificação parcial das subunidades Rpn10 e alfa 7 foram confeccionados. Após a extração de RNA total de vermes adultos seguido de RT-PCR, observou-se amplificação de produtos de aproximadamente 251 e 753 pb, de massas moleculares esperadas para os amplicons relacionados às subunidades Rpn10 e alfa 7, respectivamente. Os produtos de amplificação foram purificados do gel e clonados utilizando o sistema Gateway®. Novos ciclos de amplificação demonstraram a obtenção de plasmídeos recombinantes para as duas subunidades. Entretanto, experimentos de expressão heteróloga em bactérias BL21 não permitiram a detecção epurificação das subunidades alfa 7 e Rpn10 recombinantes no lisado celular. Como proposta alternativa, utilizou-se o plasmídeo PET28a® recombinante contendo a região codificadora da subunidade Rpn10 de S. mansoni, gentilmente cedido pela Dra. Enyara Rezende Morais (Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos - Universidade de São Paulo). Após transformação em BL21, seleção de clones recombinantes e indução com IPTG, análises por SDS-PAGE e coloração do gel por Coomassie revelaram a expressão de uma proteína recombinante de massa molecular em torno de 55 kDa. Uma preparação de Rpn10 em alto grau de homogeneidade foi obtida após purificação por afinidade em resina de níquel. Anticorpos policlonais anti-SmRpn10 recombinante foram gerados em camundongos Swiss e utilizados para avaliação do perfil de expressão de Rpn10 em extratos solúveis de cercárias, esquistossômulos (de 3h e 3 dias), vermes adultos, ovos e miracídios. A partir de eletroforese bidimensional, utilizando separação isoelétrica em gel de gradiente linear (pH 3-10) e Western blotting, foram detectadas 3 isoformas para Rpn10 em todos os estágios investigados. Essas apresentaram aumento de expressão no estágio de cercária, o qual foi novamente confirmado por Western blotting 1D comparando as fases analisadas. Este achado refere-se ao primeiro relato da existência de isoformas para a subunidade Rpn10 constituinte do proteassoma 26S e agrega diversidade ao perfil de subpopulações possíveis e alternativas deste complexo proteolítico em S. mansoniPost-genomic analyses have allowed significant advances towards understanding the biology of the human parasite Schistosoma mansoni. In particular, large scaletranscriptome experiments highlighted essential genes related to proteolytic pathways exhibiting differential expression profiles throughout the parasite´s life cycle. Such findings corroborate with the marked phenotypic alterations observed after penetration into the vertebrate host and the extensive body remodeling required for maturation of the adult stage in the hepatic portal system. The present investigation aimed to determine the expression profile of 26S proteasome constituent subunits in both larvae and adult stages. Specific oligonucleotides were first designed for amplification of the subunits Rpn10 and alpha 7. After RNA extraction from adult worms and RT-PCR, amplification products at the expected molecular size (~250 and 750 bp) related to Rpn10 and alpha 7 subunits, respectively, were obtained. The amplification products were purified from the agarose gel and cloned using the Gateway® system. New amplification cycles demonstrated the production of recombinant plasmids for the two subunits under investigation. However, heterologous expression in Escherichia coli (BL21 strain) did not allowed detection and,purification of the respective recombinant proteins from cell lysates. As an alternative, the PET28a® recombinant plasmid containing the full length Rpn10 subunit of S. mansoni was kindly provided by Dr. Enyara R. Morais (Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos – Universidade de São Paulo) and employed in this study. After transformation of BL21 E. coli cells, selection of recombinant clones and induction of expression using IPTG, SDS-PAGE analysis revealed the expression of a recombinant protein exhibiting molecular mass around 55 kDa. A homogenous fraction of His-tagged recombinant Rpn10 was obtained after its purification from the cell lysate using a nickel column. Polyclonal antibodies anti-Rpn10 were raised in Swiss mice and used for evaluation of the expression profile of this subunit in soluble extracts from cercariae, 3h schistosomula, adult worms, eggs and miracidia. A two dimensional gel approach (2-DE), using linear pH3-10 gradient for the first dimension, coupled to Western blotting revealed the existence of at least 3 isoforms for Rpn10 subunit in all investigated stages. Such isoforms exhibited upregulation in the cercariae, which was later confirmed by a comparative 1D Western blotting experiment. To our knowledge, this finding refers to the first report for the existence of Rpn10 isoforms and contributes adding further complexity to alternative possibilities of 26S proteasome assembly in S. mansoni