SEED QUALITY, MICROPROPAGATION, IN VITRO STORAGE AND ISOLATION OF GENOMIC DNA FROM Luehea divaricata Mart. & Zucc.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoLuehea divaricata Mart. & Zucc., is a native species, found in the Atlantic Forest and Pampa biomes in Rio Grande do Sul state, Brazil, belonging to the Malvaceae family. Considering the need for recovery and restoration of degraded areas, the demand for seeds and seedlings of native species may register significant increases, and the contribution of research studies to native species will be of great importance for both the forestry and the environmental sectors. This study aimed to research the quality of seeds, the development of methodologies for micropropagation and in vitro conservation of Luehea divaricata and isolation of genomic DNA of the species. Physiological and sanitary quality tests of seeds stored in Kraft paper inside refrigerator, in two different periods, collected from different places of its natural habitat, were conducted. The development of methodologies for micropropagation studies were divided in different experiments, testing at first, the response of cultures initiated from epicotyl, to stimuli from different sources and concentrations of cytokinin on in vitro multiplication. Afterwards, the pulse effect treatment with concentrations of IBA on the rooting ability of in vitro nodal segments cultivated in nutrient medium MS or WPM were tested both presence or absence of activated charcoal. For acclimatization of micropropagated plants, the effect of different concentrations of sucrose in the nutrient medium WPM and two kinds of commercial substrates were evaluated. The effect of the, osmotic regulator, mannitol, presence or absence sucrose, on the performance of in vitro nodal segments, aimed at in vitro conservation of germplasm was also observed. Three protocols were tested to isolate genomic DNA from young leaves, proving its efficiency and quality by spectrophotometry quantification and digestion with the Hind III restriction endonuclease. The main results show that genotypes differ both in their physiological and sanitary quality, and maintain their viability after six months of storage in a refrigerator. For in vitro multiplication of nodal segments, the addition of cytokinins to the nutrient medium is dispensable ,and when added, promote callus formation, unwanted at such stage. The rooting of nodal segments is successful in nutrient medium WPM in the absence of activated charcoal and it was found that the pulse treatment with IBA concentrations exceeding 9μM may optimize the process. The concentration of 30 g L-1 sucrose in the nutrient medium WPM is effective in develop plants capable of acclimatization using either commercial substrate Mecplant® or H-Decker®. It is possible in vitro conservation of nodal segments under minimal growth for a period of 120 days with the use of mannitol combined with sucrose concentrations of up to 15 g L-1 in the nutrient medium ½MS. The DNA isolated protocols were effective to obtain DNA concentration and quality still with the presence of proteins and polysaccharides. The results may contribute to the existing information on the in vitro propagation of Luehea divaricata, supporting breeding programs, germplasm conservation and analysis of genetic variability in natural populations.Luehea divaricata Mart. & Zucc., é uma espécie nativa, dos Biomas Mata Atlântica e Pampa, pertence à família Malvaceae, conhecida comumente como açoita-cavalo. Considerando-se a necessidade de recuperação e restauração de áreas degradadas, a demanda crescente por sementes e mudas de espécies florestais nativas, e a contribuição de trabalhos de pesquisa com espécies nativas será de grande importância para o setor florestal e ambiental, o presente trabalho objetivou avaliar a qualidade de sementes, analisar e selecionar metodologias para a micropropagação e para a conservação in vitro de Luehea divaricata e, também, para o isolamento de DNA genômico da espécie. Foram conduzidos testes de qualidade fisiológica e sanitária de sementes conservadas em papel Kraft no interior de refrigerador, em dois períodos distintos, coletadas em diferentes pontos de ocorrência natural da espécie. No desenvolvimento de metodologias para micropropagação os estudos foram divididos em diferentes experimentos, testando-se, primeiramente, as respostas de culturas iniciadas a partir de epicótilos, aos estímulos de diferentes fontes e concentrações de citocinina na multiplicação in vitro. Na sequência, foi avaliado o efeito do tratamento pulse com concentrações de AIB sobre a capacidade de enraizamento in vitro de segmentos nodais, cultivados em meios nutritivos MS ou WPM, na presença ou ausência de carvão ativado. Na fase de aclimatização de plantas micropropagadas foram avaliados o efeito de diferentes concentrações de sacarose no meio nutritivo WPM, e, também, de dois tipos de substratos comerciais. Foi verificado adicionalmente, o efeito do regulador osmótico manitol, associado ou não à sacarose, sobre o desempenho in vitro de segmentos nodais, visando à conservação in vitro de germoplasma. Foram testados três protocolos para isolar DNA genômico a partir de folhas jovens, comprovou-se sua qualidade e eficiência, por meio de quantificação por espectrofotometria e digestão com a endonuclease de restrição Hind III. Os principais resultados obtidos demostraram que sementes de açoita-cavalo apresentam diferenças na sua qualidade fisiológica e sanitária, e mantêm a sua viabilidade após seis meses de armazenamento em refrigerador. Para a multiplicação in vitro de segmentos nodais de açoita-cavalo a adição de citocininas ao meio nutritivo e dispensável, e quando adicionadas, promovem formação de calos, indesejados nessa fase. O enraizamento in vitro de segmentos nodais é bem-sucedido em meio nutritivo WPM na ausência de carvão ativado e obteve-se que o tratamento pulse com concentrações de AIB superiores a 9μM pode otimizar o processo. A concentração 30 g L-1 de sacarose no meio nutritivo WPM é eficiente na formação de plantas passíveis de aclimatização utilizando-se substrato comercial Mecplant® ou H-Decker®. É possível a conservação in vitro de segmentos nodais de açoita-cavalo, sob condições de crescimento mínimo, pelo período de 120 dias com a utilização de manitol combinado a concentrações de sacarose de até 15 g L-1, no meio nutritivo ½MS. Os protocolos de isolamento de DNA são eficientes em obter DNA com quantidade e qualidade aceitáveis, porém, ainda com a presença de proteínas e polissacarídeos. Os resultados obtidos poderão contribuir com as informações existentes sobre a propagação in vitro de açoita-cavalo, apoiando programas de melhoramento, conservação de germoplasma e análise da variabilidade genética de populações naturais