PRODUCTION OF CELLULOLYTIC ENZYMES FROM Trichoderma reesei BY SOLID STATE FERMENTATION AND ITS USE IN THE SACHARIFICATION OF LIGNOCELLULOSIC RESIDUES

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorSugarcane bagasse is an abundant lignocellulosic residue in traditional regions of sugar and ethanol production in Brazil. It is not only a potential substrate for second generation ethanol production but also have structural features to be classified as good inducer for cellulases production by microorganisms. However, the high cost of cellulases industrial production is the major bottleneck in the hydrolysis of this raw material for subsequent fermentation, which makes unfeasible in large scale the ethanol production using this process. In this context, the development of more efficient and less expensive fermentation processes for industrial cellulases production, as well as better alternatives of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material is crucial to achieve economic feasibility in this process. For this purpose, this work aims to develop a cellulase production process using Trichoderma reesei, as well as assessing the use of produced enzymatic extract in sugarcane bagasse hydrolysis, in order to evaluate the ultrasound effects in the hydrolysis process. The optimized process of cellulases production consisted in five days of grow in pre-inoculum Petri dishes, followed by two days of grow in optimized liquid medium and four days of solid state fermentation, using sugarcane bagasse supplemented with 1% of soybean bran and 15% (v/w) of corn steep liquor as substrate, moisture of 65%, 28±1°C and 0.5 mL of inoculum per gram of substrate. This experimental condition in bench scale (5 g) resulted in a production of 1.4 FPU/g of cellulases, and the production was approximately three-fold high in a fixed-bed bioreactor with forced aeration for 70 g of substrate capacity. For ultrasound assisted enzymatic hydrolysis using an ultrasound bath, the condition that achieved higher efficiencies were 43.4±2°C and 18.5% (v/v) of enzyme concentration, resulting in a maximal hydrolysis efficiency of 229 grams of reducing sugar per kilogram of used substrate, achieving an average increase of 12% in efficiency in those experiments where the hydrolysis was assisted by ultrasound compared with those without sonication. Regarding the saccharification using the ultrasonic probe, results using the indirect sonication during process were, on average, 158% higher than those using the direct sonication. Thus, it can be concluded that indirect sonication is more suitable to be used as an auxiliary in the hydrolysis, since the direct sonication can cause denaturation of the enzyme, reducing the process efficiency.O bagaço de cana-de-açúcar (BC) é um resíduo lignocelulósico abundante em regiões sucroalcooleiras no Brasil e é um potencial substrato para produção de etanol de segunda geração, além de possuir características estruturais que o classificam como bom indutor para produção de celulases por microrganismos. O alto custo da produção industrial de celulases, no entanto, é um grande empecilho na hidrólise desse tipo de material para posterior fermentação, o que inviabiliza a utilização desse processo na produção de etanol em larga escala. Nesse contexto, o desenvolvimento de processos de fermentação mais eficientes e de menor custo para a produção de celulases em escala industrial, bem como alternativas mais eficazes de hidrólise enzimática desse material são necessários a fim de viabilizar economicamente o processo. Para essa finalidade, esse trabalho tem como proposta o desenvolvimento de um processo para produção de celulases utilizando uma cepa do fungo filamentoso Trichoderma reesei, bem como a utilização do extrato enzimático produzido na hidrólise enzimática de bagaço a fim de avaliar os efeitos do ultrassom no processo. O processo otimizado de produção das celulases consistiu em cinco dias de crescimento do pré-inóculo em placas de Petri, seguido de dois dias de crescimento em meio líquido otimizado, e quatro dias de FES de BC suplementado com 1% de farelo de soja (FS) e 15% de água de maceração de milho (AMM), 65% de umidade, 28±1°C e densidade de 0,5 mililitros de inóculo por grama de substrato. Essa condição experimental em escala de bancada (5 g) resultou em uma produção de 1,4 FPU/g, valor esse que aumentou aproximadamente três vezes com o aumento de escala de produção em um biorreator de leito fixo com aeração forçada com capacidade para 70 g de substrato. Para hidrólise enzimática assistida por banho de ultrassom, a condição que atingiu melhores eficiências foi de 43,4±2°C e 18,5% (v/v) de concentração de enzima, atingindo um máximo de 229 gramas de açúcares redutores por quilograma de substrato utilizado, e foi observado um aumento médio de 12% na eficiência de hidrólise naqueles experimentos em que a hidrólise foi assistida por ultrassom. Já nas sacarificações utilizando a sonda ultrassônica, os resultados utilizando sonicação indireta durante a sacarificação foram, em média, 158% maiores que aqueles utilizando sonicação direta. Dessa forma, conclui-se que a utilização de sonicação indireta é mais indicada como auxiliar nas hidrólises, uma vez que a sonicação direta pode causar desnaturação da enzima e diminuir a eficiência do processo