Candida parapsilosis: echinocandin resistance and antifungal susceptibility alone and in combination

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESCandida parapsilosis is a yeast fungus that causes a wide spectrum of infections predominantly in immunocompromised patients and representing a major cause of infections related to health care. The emergence of resistance of this species to echinocandins requires the search for new therapeutic options. In this context, this thesis aimed the exposure in vitro to increasing concentrations of echinocandins in C. parapsilosis echinocandin-suscetible (ES) to obtain C. parapsilosisis echinocandinresistant (ER) to then, evaluate the susceptibility in vitro of different strains of C. parapsilosis ES and ER, against antifungal agents (amphotericin B, fluconazole, flucitosine and voriconazole) and against the combinations between these drugs, as well as evaluate the antifungal properties of diphenyl diselenide (PhSe)2 and the ebselen. Additionally, the expression levels of the FKS gene for C. parapsilosis ES and ER were checked. The evaluation of in vitro susceptibility tests based on protocols M27-A3 and M27-S4 of CLSI showed that all strains C. parapsilosis ES and ER were susceptible to amphotericin B. The strains ES showed no resistance to antifungal agents tested and the rates of resistance to fluconazole, voriconazole and flucytosine were 73.3%; 43.3% and 20% for strains ER, respectively. Furthermore, exposure of C. parapsilosis to echinocandins generated cross-resistance and resistance in vitro to azoles and flucytosine. Associations between amphotericin B, flucytosine, fluconazole and voriconazole were assessed by microdilution checkerboard method and demonstrated that for C. parapsilosis ES and ER groups, the main interaction was the indifferent activity and, in many cases the high percentage of antagonism was observed for ER strains. Through susceptibility testing based on the protocol CLSI M27-A3, can be observed that the (PhSe)2 and ebselen exhibited antifungal activity in vitro against C. parapsilosis ES, with minimal inhibitory concentration (MIC) ranging from 1-8μg/mL and 0.25-4μg/mL, respectively. However, ebselen showed the best antifungal activity against the strains ER, with MICs ranging from 0.06-4μg/mL. Additionally, the verification of the gene expression levels FKS by Real Time PCR demonstrated that the emergence of resistance to echinocandins modifies the expression levels of the FKS gene in C. parapsilosis ER. In this context, exposure in vitro to increasing concentrations of echinocandins is an important factor for the emergence of resistance in C. parapsilosis, a phenomenon that brings consequences for the susceptibility profile of this species.Candida parapsilosis é um fungo leveduriforme que causa um amplo espectro de infecções, ocorrendo predominantemente em pacientes imunocomprometidos e representando uma das principais causas de infecções relacionadas à assistência a saúde. A emergência de resistência desta espécie às equinocandinas impõe a busca por novas possibilidades terapêuticas. Neste contexto, esta tese teve como objetivos a exposição in vitro de cepas C. parapsilosis equinocandina-sensíveis (ES) a concentrações crescentes de equinocandinas, a fim de obter isolados C. parapsilosis equinocandina-resistentes (ER) para então, avaliar a suscetibilidade in vitro de diferentes isolados de C. parapsilosis ES e ER, frente a agentes antifúngicos (anfotericina B, fluconazol, fluocitosina e voriconazol), e frente a combinações entre estes fármacos, bem como avaliar as propriedades antifúngicas do disseleneto de difenila (PhSe)2 e do ebselen. Adicionalmente, foram verificados os níveis de expressão dos genes FKS para C. parapsilosis ES e ER. A avaliação dos testes de suscetibilidade in vitro com base nos protocolos M27-A3 e M27-S4 do CLSI evidenciou que todas as cepas C. parapsilosis ES e ER foram sensíveis à anfotericina B. As cepas ES não apresentaram resistência aos agentes antifúngicos testados, enquanto que as taxas de resistência ao fluconazol, voriconazol e flucitosina foram de 73,3%; 43,3% e 20% para as cepas ER, respectivamente. Ademais, a exposição de C. parapsilosis às equinocandinas gerou resistência cruzada e resistência in vitro aos azóis e flucitosina. As associações entre anfotericina B, flucitosina, fluconazol e voriconazol foram avaliadas pelo método de microdiluição checkerboard e demonstraram que para ambos os grupos C. parapsilosis ES e ER, as interações tiveram como principal atividade a indiferença, sendo que em muitos casos a alta porcentagem de antagonismo foi evidenciada para cepas ER. Através do teste de suscetibilidade baseado no protocolo M27-A3 do CLSI, pode-se observar que o (PhSe)2 e o ebselen apresentaram atividade antifúngica in vitro frente a C. parapsilosis ES, com concentração inibitória mínima (CIM) variando de 1-8μg/mL e 0,25-4μg/mL, respectivamente. Entretanto, o ebselen apresentou a melhor atividade antifúngica frente às cepas ER, com CIM variando de 0,06-4μg/mL. Adicionalmente, a verificação dos níveis de expressão dos genes FKS pela técnica de PCR em tempo real demonstrou que a emergência de resistência as equinocandinas modifica os níveis de expressão do gene FKS em C. parapsilosis ER. Neste contexto, a exposição in vitro a concentrações crescentes de equinocandinas é um fator importante para a emergência de resistência em C. parapsilosis, fenômeno este, que agrega consequências para o perfil de suscetibilidade desta espécie