Activity of swine type i interferon in protection against foot-and-mouth disease virus (FMDV)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoThe objective of this study is to evaluate the adjuvant effect of interferon alpha (IFNα) in swine vaccinated with a recombinant replication-defective adenovirus containing foot-and-mouth disease virus (FMDV) protein coding regions, as well as to understand the molecular mechanisms involved in the interaction of FMDV with its host. In the first part of this thesis, the adjuvant effect of pIFNα was evaluated in swine vaccinated with a recombinant vaccine delivered by a human adenovirus type 5 (Ad5) vector containing FMDV capsid (P1-2A) and 3Cpro proteinase coding regions (Ad5-A24). Swine were separated into 5 groups and inoculated with low (5x108 PFU) or high (5x109 PFU) doses of Ad5-A24 in the presence or absence of pIFNα (Ad5-pIFN, 109 PFU). Control animals received 6x109 PFU of an Ad5 vector containing the glycoprotein gene of vesicular stomatitis virus (Ad5-VSNJV-G). All swine were challenged at 42 days post vaccination (dpv) with FMDV-A24. Prior to challenge, blood samples were examined for IFN production, induction of IFN-induced genes (ISG s), FMDV-specific neutralizing antibodies and FMDV-specific antibody isotypes. After challenge, a number of parameters were analyzed including clinical score, viremia, lymphopenia and antibodies against FMDV structural (S) and non-structural (NS) proteins. The results indicate that both groups that received high-dose Ad5-A24 developed an FMDV-specific neutralizing antibody response by 14-21 dpv, which was maintained until the day of challenge. Both high-dose groups developed high levels of IgG1 and IgG2, however the IgG1 response was higher. The high-dose Ad5-A24 with IFN group developed higher levels of IgG1 than the group administered only high-dose Ad5-A24 and this difference was statistically significant. Antiviral activity and IFNα were detected in the groups that received IFN. The three ISG s examined, PKR, OAS and Mx1, were detected by real time RT-PCR in leukocytes from Ad5-pIFNα-vaccinated swine. After challenge, all animals in the control group developed early viremia, vesicular lesions, considerable lymphopenia and antibodies to FMDV NS proteins. The animals that received low-dose Ad5-A24 without IFN had similar clinical signs, except that fewer animals had viremia. In contrast, pigs inoculated with the low-dose Ad5-A24 and IFNα had a delayed onset of vesicular lesions and only one animal had detectable viremia. Animals vaccinated with high-dose Ad5-A24 without IFNα had no viremia, showed fewer lesions, one animal had no lesions, and delayed onset of disease compared to the low-dose Ad5-A24 groups. Four of five pigs vaccinated with high-dose Ad5-A24 and IFNα were completely protected from disease and only one animal in this group had a vesicular lesion restricted to the site of challenge virus inoculation. The results indicate that IFNα enhances the level of protection induced by the Ad5-FMD vaccine against homologous FMDV, supporting the use of IFNα as a potential adjuvant in FMD vaccination strategies. To investigate the effect of FMDV infection on the induction of the host IFN-α/β response, swine cells were infected with wild-type (WT) FMDV and a mutant FMDV lacking the L proteinase (Lpro) coding region (A12-LLV) at different multiplicities of infection. The synthesis of IFN-α and IFN-β mRNAs and three well characterized ISG s, PKR, OAS, and Mx1 mRNA, were evaluated by real time RT-PCR. A12-LLV infection resulted in significantly higher levels of induction of IFN-β mRNA as compared to WT virus infected cells, while IFN-α mRNA was not induced after either infection. The increased levels of IFN-β mRNA in A12-LLV-infected cells correlated with higher levels of induction of PKR, OAS and Mx1 mRNAs and antiviral activity. By using RNA interference (RNAi) technology to knock-down PKR mRNA expression, it was possible to demonstrate that the yield of A12-LLV was increased up to 200-fold, supporting the role of PKR as an inhibitor of FMDV replication. These results confirm that Lpro down regulates the innate immune response to FMDV infection at multiple levels. Previous studies indicated that control was at the translation initiation level by Lpro cleavage of translation initiation factor eIF-4G. The present data demonstrates that regulation also occurs at the level of transcription by inhibition of IFN-β mRNA induction through an unknown mechanism.Esse trabalho tem como objetivo avaliar o efeito adjuvante do interferon alfa suíno em animais imunizados com uma vacina recombinante de um adenovírus defectivo contendo as regiões codificadoras das proteínas do FMDV, bem como investigar alguns dos aspectos moleculares envolvidos na interação FMDV e a célula hospedeira em uma espécie susceptível. Na primeira fase do trabalho, o efeito adjuvante do interferon alfa suíno (pIFNα) foi avaliado em suínos imunizados com uma vacina recombinante, tendo como vetor o adenovirus humano tipo 5 (Ad5), contendo regiões do capsídeo do FMDV A24 e da proteinase 3Cpro do FMDV A12 (Ad5-A24). Os suínos foram separados em 5 grupos e inoculados com baixa (5x108 PFU) e alta (5x109 PFU) dosagem de Ad5-A24 na presença ou na ausência de pIFNα (Ad5pIFNα, 109 PFU). O grupo controle foi inoculado com 6x109 PFU da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV) cepa New Jersey (Ad5VSNJV-G). Todos os suínos foram desafiados aos 42 dias pós-vacinação (dpv) com FMDV-A24. Após a inoculação, as amostras de sangue foram examinadas para a produção de IFN, a indução de genes induzidos pelo IFN e os anticorpos neutralizantes e resposta de imunoglobulinas específicos para o FMDV. Depois do desafio um número de parâmetros foram analisados incluindo a avaliação clínica, viremia, linfopenia; além dos anticorpos contra as proteínas estruturais e não estruturais do FMDV. Os resultados obtidos indicam que ambos os grupos que receberam Ad5-A24 em alta dosagem desenvolveram níveis de anticorpos neutralizantes pelos 14-21 dpv, que foram mantidos até o dia do desafio. Os níveis de IgG1 foram maiores que de IgG2 nesses dois grupos, sendo que a IgG1 é considerada a mais relevante para conferir proteção ao FMDV. Dentre esses grupos, o que recebeu o IFN apresentou níveis significativamente mais altos desta imunoglobulina. Atividade antiviral e o IFNα foram detectados nos animais que receberam o IFN. A respeito da presença dos genes induzidos pelo IFN nos leucócitos dos suínos vacinados com Ad5-pIFNα, todos os três genes incluídos neste estudo, PKR, OAS e Mx1, foram detectados pelo real time RT-PCR. Após o desafio todos os animais do controle desenvolveram viremia, linfopenia, lesões vesiculares e os anticorpos contra as proteínas não estruturais do FMDV. Os animais que receberam baixa dose de Ad5-A24 sem IFN tiveram sinais clínicos similares, exceto que poucos animais desenvolveram viremia. Porém, os suínos inoculados com a mesma dose da vacina de Ad5-A24 com o IFN apresentaram as lesões vesiculares com início tardio e somente um animal teve detectável viremia. Os animais vacinados com a alta dose de Ad5-A24 sem IFN não tiveram nenhuma viremia e poucas lesões foram detectadas tardiamente após a inoculação do FMDV. Quatro dos cinco suínos, que receberam a alta dose da vacina com o IFN, foram protegidos da doença e somente um animal neste grupo teve uma lesão vesicular, restrita ao local do inoculação do vírus por ocasião do desafio. Esses resultados indicam que IFNα realça o nível da proteção induzido pela vacina do adenovírus-FMD contra o FMDV homólogo, suportando o uso do IFNα como um adjuvante potencial em estratégias de vacinação de FMD. Para avaliar os efeitos da infecção pelo vírus da FMD na indução da resposta de IFNα⁄β do hospedeiro, células de origem suína foram previamente infectadas em diferentes multiplicidades de infecção com o FMDV e com um vírus mutante que teve o gene que codifica a protease L ou Lpro deletado, o FMDLLV. A síntese de mRNA do IFNα e β bem como de três dos genes induzidos pelo IFN, PKR, OAS e Mx1 foram avaliados por real time RT-PCR. A infecção das células pelo FMDLLV induziu altos níveis de mRNA do IFNβ quando comparados com os do FMDV original. Contudo, não foi possível detectar os níveis de mRNA do IFNα na presença de ambos os vírus. O aumento nos níveis de mRNA do IFNβ foi relacionado ao aumento nos níveis de indução dos mRNAs de PKR, OAS e Mx1, assim como dos altos níveis de atividade antiviral. Pelo uso da tecnologia de interferência do RNA, usando siRNA (silencing RNA) para bloquear a expressão do mRNA da PKR, foi possível demonstrar que o título do FMDLLV aumentou cerca de 200 vezes. Desta forma foi possível confirmar o papel desta proteína como um inibidor da replicação do FMDV. Os resultados obtidos demonstram que a Lpro tem um importante papel na regulação da resposta imunológica inata do hospedeiro quando da infecção pelo FMDV em vários níveis. Estudos anteriormente realizados indicaram que o controle era efetuado ao nível da tradução pela clivagem do eIF4G. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a regulação também ocorre ao nível da transcrição e pela inibição da indução do IFNβ através de um mecanismo ainda não conhecido