Production of surfactin by Bacillus amyloliquefaciens MO.04b in mixed agroindustrial waste

O Brasil, importante no cenário agrícola mundial, é produtor de soja, grão de alto teor proteico, cana de açúcar e arroz. Essas culturas, quando processadas, geram materiais que são potenciais substratos para o cultivo microbiano e produção de metabólitos de alto valor agregado. A fermentação em estado sólido (FES) possibilita o cultivo de microrganismos em condição de baixo teor de umidade e favorece o aproveitamento de diferentes resíduos agroindustriais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de surfactina, um biossurfctante lipopeptídico, por FES, utilizando o Bacillus amyloliquefaciens MO.04b. O microrganismo foi cultivado em mistura de resíduos agroindustriais contendo farelo de soja, bagaço de cana-de-açúcar e casca de arroz, umedecidos com solução de sais acrescida de glicose 0,2 % (m/v), inoculados com suspensão de células (107 - 108 UFC mL-1) e incubados a 37 ± 2 °C. Após a interrupção da FES com água destilada, a mistura foi homogeneizada, a biomassa determinada por turbidimetria a 600 nm e contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Essa mistura foi submetida a centrifugação a 3.500 x g por 15 minutos. O peso do material sólido fermentado foi determinado por gravimentria e o extrato livre de células (ELC) utilizado para a determinação do pH (inicial e final), da atividade das enzimas proteases, xilanases, celulases e lacases, das proteínas totais e dos açúcares totais e redutores. Os lipipeptídeos contidos no ELC foram precipitados com adição de HCl 6 mol L-1 até pH 2,0 e mantido em repouso durante 12 horas e extraídos com a mistura de clorofórmio e metanol [CHCl3:CH3OH (4:1)]. O material obtido foi então liofifizado. A quantificação de surfactina foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O pH final dos cultivos foi crescente ao longo do tempo de cultivo e atingiu o máximo de 8,5 em 72 horas, assim como a biomassa, que cresceu ao longo do tempo, até 18 24 horas, atingindo o máximo de 1 x 108 UFC mL-1. Quanto ao material sólido fermentado, foi verificada a redução progressiva do peso seco, de 1,2207g (0 horas) até 0,9268 g (72 horas), mostrando que em 72 horas de cultivo o microrganismo hidrolisou 25 % do total dos resíduos agroindustriais. A atividade de proteases e xilanases foram 0,946 U mL-1 e 0,81 U mL-1, respectivamente, entre 6 e 12 horas de cultivo. Não foram detectadas atividades de celulase e lacase. A surfactina foi produzida em todos os períodos analisados, e teve maior produção em 18 horas de cultivo, de 64,15 mg mL-1. A mistura de resíduos utilizada favoreceu o crescimento do microrganismo, o qual foi capaz de consumir 25 % dos resíduos nas condições de FES apresentadas. Tais condições propiciaram à bactéria a produção das enzimas protease e xilanase e de surfactina, cuja maior produção ocorreu em 18 horas de cultivo.Brazil, important in the world's agricultural scenario, is a producer of soybeans, high-protein grain, sugar cane and rice. These cultures, when processed, generate materials that are potential substrates for the microbial culture and production of metabolites of high added value. A solid state fermentation (FES) allows the cultivation of microorganisms in a condition of low moisture content and favors the use of different agroindustrial residues. The objective of this work is to evaluate the production of surfactin, a lipopeptide biosurfactant, by FES using Bacillus amyloliquefaciens MO.04b. The microorganism was cultivated in a mixture of agroindustrial residues containing soybean meal, sugarcane bagasse and rice husk, moistened with salt solution plus 0.2% glucose (m/v), inoculated with cell suspension (107-108 CFU ml-1) and incubated at 37 ± 2 °C. After interruption of FES with distilled water, the mixture was homogenized, the biomass determined by turbidimetry at 600 nm and counting of the colony forming units (CFU). This mixture was subjected to centrifugation at 3500 x g for 15 min. The weight of the fermented solid material was determined by gravimetry and the free cell extract (ELC) used for the determination of the pH (initial and final), activity of enzymes protease, xylanases, cellulases and laccases, total proteins, total sugars and reduced sugar. The lipids contained in the ELC were precipitated with addition of 6 mol L-1 HCl to pH 2.0 and held for 12 hours and extracted with a mixture of chloroform and methanol [CHCl3:CH3OH (4:1)]. The obtained material was then lyophilized. The quantification of surfactin was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). The final pH of the cultures was increased over the growing time and reached the maximum of 8.5 in 72 hours, as well as the biomass, which grew over time, up to 18 - 24 hours, reaching a maximum of 1 x 108 CFU mL-1. As regards the fermented solid material, a progressive reduction of dry weight was observed from 1.2207g (0 h) to 0.9268 g (72 h), showing that in 72 h of culture the microorganism hydrolyzed 25% of the total agroindustrial waste. The activity of proteases and xylanases were 0.946 U mL-1 and 0.81 U mL-1, respectively, between 6 and 12 hours of culture. No cellulase and laccase activities were detected. Surfactin was produced in all analyzed periods, and had a higher production in 18 hours of culture, of 64.15 mg mL-1. The mixture of residues used favored the growth of the microorganism, which was able to consume 25% of the residues under the FES conditions presented. These conditions allowed the bacterium to produce protease and xylanase and surfactin enzymes, whose highest production occurred in 18 hours of culture