Análise polifásica aplicada à taxonomia e filogenia de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)

Solos agrícolas submetidos a práticas de manejo intensivo e inadequado são prejudicados física, química e biologicamente, levando ao esgotamento de nutrientes e perda de atividade biológica, tornando-os ineficazes para o cultivo. Sabe-se que bactérias conhecidas como rizóbios podem fixar o N2 atmosférico, suprindo total ou parcialmente as necessidades em nitrogênio de plantas, especialmente da família Leguminosae (=Fabaceae). Desta maneira, a caracterização molecular e filogenética de rizóbios nativos de solos brasileiros é importante para estudos futuros, visando aumentar a produtividade agrícola sem agredir o meio ambiente. Atualmente, a filogenia do gene ribossomal 16S rRNA representa a base para estudos taxonômicos de procariotos, mas a alta conservação do mesmo dificulta a identificação e a classificação taxonômica de espécies estritamente relacionadas. Além disso, a ocorrência de transferência horizontal e recombinação genética pode comprometer a análise. Assim, o emprego da metodologia de MLSA (Multilocus Sequencing Analysis) tem conferido maior confiabilidade a estudos taxonômicos e de filogenia. Tal metodologia consiste em uma análise concatenada de três a cinco genes do metabolismo basal de bactérias (genes housekeeping), os quais permitem a discriminação de espécies bastante próximas, mas que são conservados o suficiente para estabelecer relações filogenéticas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade taxonômica e filogenética de estirpes de Rhizobium simbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Foram realizados dois estudos, ambos contendo estirpes atualmente classificadas como Rhizobium tropici, as quais foram submetidas a uma análise polifásica envolvendo caracterização morfofisiológica (aspectos da colônia, utilização de fontes de carbono e tolerância a antibióticos), genética (BOX-PCR) e filogenética (MLSA). No primeiro estudo, os resultados foram congruentes em todas as análises, onde as cinco estirpes apresentaram características que as distinguiram das demais espécies de Rhizobium utilizadas como referência. Nos resultados de BOX-PCR e MLSA, as mesmas formaram clusters separados das demais espécies do gênero, reforçando a hipótese de que podem representar uma nova espécie de Rhizobium. No segundo estudo, as estirpes apresentaram perfis morfofisiológicos e genéticos pouco similares entre si, e os resultados de MLSA agruparam-nas com diferentes estirpes de referência, apontando diversidade entre as mesmas. Em ambos os estudos a metodologia de MLSA mostrou-se bastante eficiente na definição da posição filogenética das estirpes e forneceu suporte para estudos futuros. A aplicação da análise polifásica foi bastante promissora em ambos os estudos, especialmente no primeiro, onde confirmou os dados obtidos com MLSA e indicou as estirpes como fortes candidatas a novas espécies.Agricultural soils submitted to intense and inadequate management practices are physically, chemically and biologically damaged, leading to an impoverishment of nutrients and loss of biological activity, thus inefficient for cultivation. It is known that bacteria called rhizobia can fix the atmospheric N2, supplying totally or partially the nitrogen needs of plants, with an emphasis on plants of the Leguminosae (=Fabaceae) family. Therefore, the molecular and phylogenetic characterization of indigenous Brazilian rhizobia is important for further studies, in order to increase agricultural productivity without harming the environment. Currently, the phylogeny of 16S rRNA represents the basis of the prokaryotic taxonomy, but its high conservation makes it difficult to identify and classify taxonomically closely related species; besides, the occurrence of horizontal gene transfer and genetic recombination may compromise the taxonomic study. Thus, the use of MLSA (Multilocus Sequencing Analysis) methodology has conferred higher reliability to taxonomic and phylogeny studies. The method consists of a concatenated analysis of three to five genes related to the basal metabolism of bacteria (housekeeping genes), that allow the discrimination of very close species, but that are also sufficiently conserved to allow the establishment of phylogenetic relationships. The objective of this study was to characterize taxonomically and phylogenetically the diversity of Rhizobium strains symbionts of common bean (Phaseolus vulgaris L.). Two studies were conducted, both containing strains currently classified as Rhizobium tropici witch were submitted to a polyphasic analysis, involving morpho-physiologic (colony morphology, carbon source utilization and antibiotic tolerance), genetic (BOX-PCR) and phylogenetic (MLSA) characterization. In the first study, the results were congruent in all tests, and the five strains showed unique properties, which distinguished them from the other Rhizobium species utilized as reference. In the BOX-PCR and MLSA analysis, the strains were grouped separated from the other rhizobial species, reinforcing the hypothesis that they might represent a new species of Rhizobium. In the second study, the strains showed highly dissimilar morpho-physiologic and genetic profiles, and the MLSA results clustered them with different reference strains, indicating high diversity within this group. In both studies, the MLSA methodology proved to be of great efficiency in defining the phylogenetic position of the strains, and provided support for further studies. The polyphasic analysis was highly promising, especially in the first study, where it confirmed the data obtained by MLSA and pointed out strains as strong candidates of new species