PCR multiplex para detecção de Campylobacter spp. e Salmonella spp. em carne de frango

O Brasil é o terceiro produtor e o primeiro exportador mundial de carne de frango, sendo o Estado do Paraná o segundo maior produtor brasileiro. Salmonella spp e Campylobacter spp são as causas mais frequentes de doenças bacterianas transmitidas por alimentos no mundo e os produtos avícolas apontados como os principais veículos de transmissão para o ser humano. O monitoramento dessas bactérias em carne de frango, é fundamental para evitar que barreiras sanitárias possam interferir na comercialização, como também, é essencial para o controle da doença humana. Os métodos convencionais de isolamento de Campylobacter e Salmonella em alimentos podem requerer de quatro a dez dias para a conclusão dos resultados. Métodos moleculares, como a PCR, têm sido otimizados para detecção, identificação e quantificação dessas bactérias em alimentos, devido à rapidez, especificidade e sensibilidade. Embora vários kits comerciais estejam disponíveis, o seu alto custo dificulta o uso nos laboratórios de diagnóstico e controle de qualidade, principalmente em países em desenvolvimento como o Brasil. A padronização de um ensaio molecular específico e, principalmente, a detecção simultânea dessas duas bactérias patogênicas vem de encontro à necessidade desses laboratórios. O objetivo desse trabalho foi otimizar um ensaio de PCR multiplex (mPCR) para a detecção simultânea de Salmonella spp. e Campylobacter spp. em carne de frango. A mPCR otimizada utilizou o par de iniciadores Styinva-JHO-Right e Styinva-JHO-Left, específico para Salmonella spp., que gerou um amplicon de 119 pares de bases. O par de iniciadores específico para Campylobacter spp. foi OT1559 e 18-1 gerando um amplicon de 287 pares de bases. A especificidade do ensaio mPCR otimizado foi de 100%, testada com culturas puras de diferentes sorovares de Salmonella, C. jejuni, C. coli e outras espécies bacterianas. A reação de mPCR otimizada detectou 102 UFC/mL de Campylobacter spp. e 100 UFC/mL de Salmonella spp., após 24 horas de enriquecimento. Das 50 amostras de carne de frango analisadas, adquiridas no comércio de Londrina, duas (4%) estavam contaminadas com Salmonella spp. e 28 (56%) com Campylobacter spp. A presença dessas bactérias foi confirmada pelo método tradicional de cultura. A mPCR padronizada neste trabalho é uma alternativa rápida, barata e eficiente para detecção simultânea de Samonella spp. e Campylobacter spp. em carne de frango, após 24 horas de enriquecimento.Brazil is the world's third largest producer and leading exporter of chicken meat, and the State of Paraná is the second largest Brazilian producer. Salmonella spp. and Campylobacter spp. are the most frequent causes of food-borne diseases worldwide. The control of these bacteria in chicken meat is essential to prevent sanitary barriers and it is essential for the control of human disease. Conventional detection methods of Campylobacter and Salmonella in food demand four to ten days. Molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) have been developed for detection, identification and quantification of those bacteria in foods due to their rapididy, specificity and sensitivity. Although there are several commercial available kits, their high cost makes routine use in quality control and diagnostic laboratories difficult, especially in developing countries such as Brazil. The development of a specific molecular assay and especially the simultaneous detection of both pathogenic bacteria would be essential for these laboratories. The aim of this study was to develop a multiplex PCR assay (mPCR) for simultaneous detection of Salmonella spp. and Campylobacter spp. in raw chicken meat. The mPCR was developed using the primers Styinva-JHO-Right and Styinva-JHO-Left specific for Salmonella spp. that amplified a 119 bp fragment. The primers specific for Campylobacter spp was OT1559 and 18-1 which amplified DNA fragments of 287 bp. The assay specificity was 100% after test with different Salmonella serovars, Campylobacter jejuni, C. coli and other bacterial species in pure cultures. The mPCR detected 102 CFU/mL of Campylobacter spp. and 100 CFU/mL of Salmonella spp. after 24 hours of enrichment. A total of 50 raw chicken meat samples were analyzed and two (4%) were contaminated with Salmonella spp. and 28 (56%) with Campylobacter spp. The results of mPCR were confirmed by conventional culture method. The developed mPCR is a rapid, inexpensive and eficient alternative for the simultaneous detection of Samonella e Campylobacter in chicken meat after 24 h enrichment