Genômica e diversidade de Rhizobium Tropici, uma espécie tropical microssimbionte do feijoeiro Phaseolus Vulgaris L

O Brasil é o maior produtor e consumidor mundial de feijão (Phaseolus vulgaris L.). O rendimento médio nacional é bastante baixo, devido, principalmente, ao baixo nível de tecnologia empregado na cultura, ao cultivo em solos de baixa fertilidade, especialmente pobres em N. Conseqüentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose com bactérias diazotróficas, representa uma alternativa para aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, contudo, problemas relacionados à nodulação e fixação do N2 com as estirpes nativas dos solos são relatados com freqüência. Neste trabalho foram conduzidos dois estudos, sendo que no primeiro foi realizada à caracterização de diversidade genética, pela avaliação de genes simbióticos e não simbióticos, de estirpes de Rhizobium tropici, com alta capacidade de fixação do N2 em condições tropicais e isoladas de quatro regiões brasileiras. A técnica de PCR-RFLP dos genes ribossomais 16S e 23S e a análise do seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiram a identificação de dois grupos, um relacionado às estirpes de R. tropici tipo A e outro às de R. tropici tipo B. A diversidade dos genes ribossomais foi elevada, indicando que as estirpes do tipo A podem representar uma nova espécie. Além disso, foi constatada diversidade genética intraespecífica elevada, pela análise por rep-PCR com os -primers" BOX, ERIC e REP. Contudo, na análise de PCR-RFLP dos genes simbióticos, nifH e nodC, todas as estirpes de R. tropici apresentaram uma única combinação de perfis, o que pode refletir uma estratégia evolucionária dessas estirpes para a maximização da fixação de N2. No segundo estudo foi realizado o seqüenciamento e a bioprospecção parcial de genes da estirpe PRF 81 (=SEMIA 4080) de R. tropici, altamente eficiente no processo de fixação do N2 e recomendada para o uso de inoculantes comerciais no Brasil. O genoma dessa estirpe foi estimado em 7,85 Mb, pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Foram obtidas 2192 CDSs, sendo classificadas como válidas (1255), hipotéticas conservadas (668) ou hipotéticas (269). A estratégia de panorama genômico, para a obtenção de genoma parcial, mostrou-se viável e eficiente, uma vez que foram identificados genes putativos na maioria das classes funcionais dos bancos de dados KEGG e COG. Foram identificados genes do metabolismo de aminoácidos, carboidratos e lipídeos, bem como relacionados à biodegradação, quimiotaxia e, provavelmente, a mecanismos de infecção, com ênfase em genes relacionados aos sistemas de secreção dos tipos II e III. Além disso, foram identificados genes relacionados à capacidade competitiva, saprofítica e ao processo de fixação biológica do N2. A estratégia de panorama genômico utilizada na estirpe PRF 81 indicou um mosaico de similaridade com diversos outros rizóbios. Além disso, foram identificados alguns genes promissores para manipulações futuras visando obter incrementos no processo de fixação biológica do N2, não só com o feijoeiro, como em outras leguminosas.Brazil is the largest worldwide bean (Phaseolus vulgaris L.) producer and consumer. The average domestic yield is quite low, mainly due to the low level of technology employed in the crop, and to cultivation in low fertility soils, especially those that are poor in N. Consequently, an adequate supply of N provided by symbiosis with diazotrophic bacteria represents an alternative to increase domestic yield at low cost; however, problems related to nodulation and N2 fixation with native strains in the soils are frequently reported. In this work, two studies were conducted: the first we performed a genetic diversity characterization, by evaluating symbiotic and non-symbiotic genes from Rhizobium tropici strains with high N2 fixation capacity under tropical conditions, isolated from four Brazilian regions. The PCR-RFLP analysis for ribosomal genes 16S and 23S, and the sequencing analysis for gene 16S rRNA allowed two groups to be identified, one related to R. tropici type A and another to type B R. tropici strains. A high diversity of ribosomal genes was obtained, indicating that type A strains may represent a new species. In addition, high intraspecific genetic diversity was verified via rep-PCR analysis using BOX, ERIC, and REP primers. However, in the PCR-RFLP analysis for the symbiotic genes nifH and nodC, all R. tropici strains presented only one combination of profiles, which might reflect an evolutionary strategy of these strains to maximize N2 fixation. In the second study, consisted in the sequencing and partial bioprospecting of genes of the R. tropici PRF 81 strain (=SEMIA 4080), highly effective in the N2 fixation process and recommended to be used with commercial inoculants in Brazil. The genome of this strain was estimated at 7.85 Mb by the pulsed field gel electrophoresis technique (PFGE). We obtained 2192 CDSs, classified as valid (1255), conserved hypothetical (668), or hypothetical (269). The draft genome strategy to obtain partial genomic sequences proved viable and effective, since putative genes were identified in most functional classes of the KEGG and COG databases. Genes for the metabolism of amino acids, carbohydrates, and lipids were identified, as well as genes related to biodegradation, chemotaxis and, probably, infection mechanisms, with emphasis on genes related to type II and type III secretion systems. In addition were identified genes related to competitive and saprophytic capacity and to the N2 biological fixation process. The draft genome strategy used for strain PRF 81 indicated a mosaic of similarity with several other rhizobia. In addition, some promising genes were identified for future manipulations aimed at obtaining increases in the N2 biological fixation process, not only in bean plants, but in other legume