Diversity among strains belonging to the genus Bradyrhizobium evaluated by Multilocus Sequence Analysis (MLSA) and Polyphasic Analyses

Bactérias simbióticas fixadoras de nitrogênio, também denominadas popularmente de rizóbios, têm grande relevância agronômica, pois fornecem quantidades significativas de nitrogênio para as plantas e colaboram para a recuperação de solos e ambientes degradados. Nos últimos anos, com o avanço das técnicas moleculares, diversos trabalhos têm demonstrado que essas bactérias apresentam uma elevada diversidade genética, resultando em reclassificações taxonômicas e na descrição de novas espécies. Apesar de o gene ribossomal 16S (16S RNAr) ainda ser utilizado em análises filogenéticas de procariotos, sua alta conservação não é capaz de revelar diferenças entre espécies de diversos gêneros, incluindo Bradyrhizobium. Outras metodologias, como o MLSA (Multilocus Sequence Analysis), estão sendo utilizadas para elucidar esses casos, com bons resultados. Neste trabalho, 15 estirpes de Bradyrhizobium sem posicionamento taxonômico claro foram utilizadas em estudos de filogenia e taxonomia com base na técnica de MLSA e análise polifásica. Para isso, três genes housekeeping?glnII, gyrB e recA?foram sequenciados e suas sequências foram concatenadas e utilizadas para a construção de uma árvore filogenética. Das 15 estirpes, sete agruparam com a espécie Bradyrhizobium pachyrhizi, enquanto as SEMIAS 6159, 6405 e 6408 ocuparam posições isoladas, e dois grupos (SEMIAS 6399 e 6404, e SEMIAS 690, 6387 e 6428) não apresentaram similaridade filogenética com nenhuma espécie descrita. Esses grupos merecem estudos mais detalhados, pois apresentam grande potencial de representarem espécies novas. As estirpes SEMIA 690 (isolada de Centrosema pubescens), SEMIA 6387 e SEMIA 6428, (isoladas de Acacia spp.) foram selecionadas para análises complementares, visando à descrição de uma nova espécie, tendo início um estudo polifásico (análises genéticas, fenotípicas e filogenéticas). O perfil de BOX-PCR agrupou as estirpes com mais de 73% de similaridade entre si, e inferiores a 66% com as espécies de Bradyrhizobium já descritas. Os ácidos graxos identificados como principais na SEMIA 690 foram a fração molecular total 8 e a fração individual C19:0 ciclo ?8c. A SEMIA 690 apresentou identidade nucleotídica média do genoma inferior a 91% com todas as estirpes tipo das espécies relacionadas. O conteúdo G + C da SEMIA 690 foi determinado em 63,46%. Os testes fenotípicos (fontes de carbono utilizadas, características morfológicas, condições de crescimento) foram congruentes entre as estirpes representantes da provável nova espécie. Os resultados obtidos confirmam que a técnica de MLSA é eficiente para estudos filogenéticos de procariotos, mostrando ser uma ferramenta segura e rápida de análise da diversidade dos gêneros e identificação de possíveis novas espécies. Os resultados suportam a descrição de uma nova espécie de Bradyrhizobium.Symbiotic nitrogen-fixing bacteria, also commonly called rhizobia, have great agronomic relevance because they can provide significant amounts of nitrogen to plants and help in the recovery of soils and degraded environments. In recent years, with the advances in molecular techniques, several studies have shown that these bacteria have a high level of genetic diversity, resulting in taxonomic reclassifications and description of new species. Although the 16S ribosomal genes (16S rRNA) are still used in phylogenetic analyses of prokaryotes, their high conservation do not allow to reveal differences between species of several genera, including Bradyrhizobium. Other methodologies such as the MLSA (Multilocus Sequence Analysis) are being used to elucidate these cases, with good results. In this study, 15 strains of Bradyrhizobium without clear taxonomic position were used in studies of phylogeny and taxonomy based on the MLSA technique. Tree housekeeping genes?glnII, gyrB and recA?were sequenced and their sequences were concatenated and used for the construction of a phylogenetic tree. Of the 15 strains, seven grouped with the species Bradyrhizobium pachyrhizi, while the SEMIAS 6159, 6405 and 6408 strains occupied isolated locations, and two groups (SEMIAS 6399 and 6404, and SEMIAS 690, 6387 and 6428) showed no genetic similarity with any described species. These groups deserve more detailed studies, since they have great potential to represent new species. Strains SEMIA 690 (isolated from Centrosema pubescens), SEMIA 6387 and SEMIA 6428, (isolated from Acacia spp.) were selected for a polyphasic study (genetic, phenotypic and phylogenetic analyzes) aimed at the description of a new species. The BOX-PCR profile clustered the strains with more than 73% of similarity, and less than 66% with closer Bradyrhizobium described species. Fatty acids identified as key in SEMIA 690 were summed features 8 and individual fraction C19:0 cycle ?8c. The genomic analysis of ANI (average nucleotide identity) between SEMIA 690 and closer type strains of Bradyrhizobium species was less than 91%. The G + C content from SEMIA 690 was of 63.46%. The phenotypic tests (carbon sources used, morphological characteristics, growth conditions) were congruent among the strains representative of the new putative species. The results confirm that the MLSA technique is efficient for phylogenetic studies of prokaryotes, representing a reliable and fast tool to analyze the diversity of genes and to identify possible new rhizobial species. The results obtained in this study also support the description of a new species of Bradyrhizobium