Diversidade de rizóbio capaz de nodular o feijoeiro (Phaseolus vulgaris) isolado de solos da região nordeste e da região sul do Brasil

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é considerado a leguminosa mais importante para a nutrição humana no mundo e, no Brasil, representa de 20 a 28% das proteínas ingeridas pela população. Entretanto, a falta de tecnologia e o cultivo em solos marginais contribuem, decisivamente, para a queda na produtividade da cultura do feijoeiro e, nesse quadro, o fornecimento adequado de nutrientes, particularmente o nitrogênio (N), representa um dos fatores limitantes à obtenção de maiores rendimentos. O processo de fixação biológica do N2 (FBN), pela associação do feijoeiro com bactérias do gênero Rhizobium, pode fornecer N à cultura, porém, os benefícios da inoculação são muitas vezes limitados, devido a características intrínsecas do macro e do microssimbionte e, também, a fatores ambientais. Acredita-se que um dos principais fatores limitantes resida na população elevada de rizóbio nativa dos solos brasileiros, que é muito competitiva, mas pouco eficiente, reduzindo a probabilidade de sucesso da inoculação com estirpes mais eficientes no processo de FBN. Conseqüentemente, para que as respostas à inoculação sejam consistentes é essencial conhecer, num primeiro estágio, a diversidade das populações de rizóbio nas principais regiões produtoras e sua relação com a resposta à inoculação. Com o objetivo de conhecer melhor a diversidade da população de rizóbio capaz de nodular o feijoeiro no Brasil, bem como de explicar as variações nessa diversidade sob diferentes condições ambientais, este estudo caracterizou 243 isolados provenientes de dois ecossistemas distintos: Pernambuco, com solos alcalinos e clima semi-árido e Paraná, com solos ácidos e clima tropical e subtropical. A diversidade foi avaliada pela determinação da variabilidade genética e simbiótica dos isolados. Para isso, foram avaliados parâmetros genéticos através do uso de métodos de biologia molecular: amplificação do DNA pela reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) com o oligonucleotídeo ("primer") específico ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus); análise do perfil de DNA pela técnica de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e seqüenciamento, parcial ou total, da região genômica do 16S rDNA. A análise dos resultados obtidos nesses três parâmetros genéticos foi realizada usando o método de agrupamento com o algaritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method, arithmetic averages). Através da análise do dendrograma com perfis de DNA obtidos por PCR-ERIC, foi evidente o grau elevado de diversidade genética entre 209 isolados, com 80,8% representando estirpes únicas. Para a investigação das relações filogenéticas das bactérias a nível de espécie, foi utilizada a técnica de PCR-RFLP com amplificações da região 16S rDNA e cinco enzimas de restrição, Nde II, Rsa I, Hinf I, Cfo I e Msp I. Novamente constatou-se um grau elevado de polimorfismo, com 36 combinações distintas de perfis e, de 107 estirpes analisadas por essa técnica, 68,2% apresentaram perfis semelhantes à espécie R. etli. Para confirmar as relações filogenéticas, as estirpes investigadas foram submetidas à análise do seqüenciamento, parcial ou total, da região correspondente ao 16S rDNA. Foi possível constatar que, das 34 estirpes investigadas por essa técnica, 22 apresentaram alta similaridade com R. etli e R. mongolense e, algumas estirpes, identificadas como Rhizobium sp., apresentaram dissimilaridade elevada em relação às espécies de rizóbio já descritas. Em relação à caracterização simbiótica, das 34 estirpes seqüenciadas, nenhuma foi capaz de nodular Leucaena leucocephala, incluindo aquelas com similaridade genética com R. tropici. A instabilidade dos genes de nodulação do rizóbio foi evidenciada em uma porcentagem elevada de estirpe pois, pela reinoculação das bactérias seqüenciadas em feijoeiro, 26,4% perderam a capacidade de nodulação.Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is considered the most important legume for human nutrition worldwide and in Brazil represents from 20 to 28% of the proteins consumed by the population. However, poor technology and cropping in low-fertile soils contribute to a decrease in grain yield; adequate supply of nutrients, especially the nitrogen (N) represents a main factor to obtain higher yields. The process of biological nitrogen fixation (BNF), by the association of common bean plants with bacteria belonging to the genus Rhizobium, can supply the N necessary to the crop, however, benefits of inoculation are often limited due to intrinsic characteristics of the macro and microsymbiont as well as due to environmental factors. Probably the main limitation relies on a high population of indigenous and competitive rhizobia, decresing the probability of success of inoculation with more efficient strains. Therefore to find more consistent responses to inoculation, it is important to know at a first stage, the diversity of the rhizobial population in the main producing regions as well as the relationship beeween this diversity and the response to inoculation. Aiming to know better the diversity of rhizobial population able to nodulate common bean, as well as to explain differences in the diversity due to different environmental conditions, this study characterized 243 isolates from two distinct ecosystems: alkaline soils of Pernambuco with a semi-arid climate, and acid soils of Paraná with tropical and subtropical climate. The diversity was evaluated by the determination of genetic and symbiotic variability. For that the following genetic parameters were evaluated using molecular biology tools: DNA amplification by the PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction with the specific primer ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus); analysis of DNA profile by the PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) technique, and total or partial sequencing of the genomic region corresponding to the 16S rDNA. The analysis of the results obtained with these three genetic parameters was realized using the algorithm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method, arithmetic averages). The analysis of the dendrogram obtained with the ERIC-PCR profiles showed a high level of genetic diversity among 209 isolates, with 80.8% representing unique strains. For the investigation of the bacteria phylogeny at the species level the PCR-RFLP was used with amplifications of the 16S rDNA and five restriction enzymes, NdeII, RsaI, HinfI, CfoI and MspI. Again a high level of polymorphism was verified, with 36 different combinations of profiles and 68.2% out of the 107 strains studied showed similar profiles to R. etli. To confirm the phylogenetic relationships 34 strains were submitted to partial or total sequencing of a DNA fragment corresponding to the 16S rRNA region. It was possible to verify that 22 strains showed similarity with R. etli and R. mongolense and some strains, classified as Rhizobium sp. showed high dissimilarity in relation to the described rhizobial species. Em relation to the symbiotic characterization of the 34 sequenced strains, none was able to nodulate Leucaena leucocephala, including those showing genetic similarity with R. tropici. The instability of the rhizobial nodulation genes of a high percentage of the isolates was shown by the reinoculation of the sequenced strains in common bean plants with 26.4% loosing the capacity of nodulation