Diterpenos em Coffea arabica : aspectos bioquímicos, e caracterização in silico e transcricional de genes de Cyt P450s candidatos na biossíntese de cafestol e caveol

O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de café e o segundo maior mercado consumidor. Estudos visando a melhoria da qualidade da bebida e da tolerância de plantas a estresses bióticos e abióticos são importantes para o agronegócio café. As propriedades nutracêuticas da bebida e mecanismos de defesa da planta estão relacionadas aos diterpenos presentes na fração lipídica de grãos de café, como o cafestol (Caf) e caveol (Cav). As etapas finais de biossíntese destes compostos ainda não foram elucidadas, mas estudos relacionados ao metabolismo secundário de plantas indicam o envolvimento de membros da família gênica das citocromos P450s (Cyt P450). No intuito de caracterizar aspectos bioquímicos e genéticos da biossíntese destes compostos, foram realizadas caracterizações bioquímicas de diterpenos em frutos de café e a caracterização molecular de genes da família das P450s em Coffea spp. Foram quantificados por CLAE os teores de Caf e Cav em: i) botão floral, flor e perisperma de frutos (30 e 210DAF e ii) frutos com 120DAF tratados com metil jasmonato 2μM (MJ). Há um pico de concentração de Cav em perisperma de frutos aos 120DAF (284% mais caveol do que em 90DAF), com queda acentuada aos 150DAF e 396% mais Caf em 120DAF do que em 150DAF. Há uma inversão nas concentrações de Caf e Cav do botão floral/flor (predomínio de Caf) para os frutos (predomínio de Cav). A concentração de diterpenos em frutos (120DAF) tratados com 2μM metil jasmonato (MJ) foi determinada durante o período de 24, 48 e 96 horas. Frutos após 48 horas do tratamento com MJ apresentaram a maior diferença na concentração de diterpenos em relação aos frutos não tratados com um aumento de 48 e 19% de Caf e Cav, respectivamente. Neste trabalho foram também identificadas 84 Cyt P450s transcricionalmente ativas em Coffea spp., provenientes de sequências ESTs do Projeto Brasileiro Genoma Café. Destes, oito genes candidatos foram escolhidos para avaliação transcricional por qPCR em folhas, flores e frutos em 3 períodos de desenvolvimento (90DAF, 120DAF e 150DAF). Sete genes apresentaram expressão diferencial entre os tecidos analisados, Os contigs C22_1 e C25_1 expressaram mais em folhas e apresentaram baixa atividade transcricional nos demais tecidos analisados. Por outro lado os contigs C19_2, C28_1 e C37_2 tiveram uma alta expressão relativa em flor enquanto que os contigs C33_1 e C107_1 apresentaram uma expressão maior em frutos com 90DAF. Esses últimos cinco contigs têm grande potencial de estarem envolvidos nas etapas finais da via metabólica de Caf e Cav.Brazil is coffee largest producer and exporter, and the second largest consumer market. Studies aiming the beverage quality improvement and plant tolerance to biotic and abiotic stresses are important to coffee agrobusiness. Nutraceutical properties in beverage and plant defense mechanisms are directly related to diterpenes present in the lipid fraction of coffee beans, such as cafestol (Caf) and kahweol (Cav). The final steps of Caf and Cav biosynthesis have not been elucidated yet, but plant secondary metabolism studies indicate the involvement of membersfrom cytochrome P450s gene family (Cyt P450). In order to depict genetic and biochemical aspects of Caf and Cav biosynthesis, it was performed the biochemical quantification of these diterpenes in coffee fruits and the molecular characterization of members from Cyt p450s family in Coffea spp. Levels of Caf and Cav were quantified by HPLC on: i) bud flower, flower and fruits perisperm (30 to 210DAF) and ii) at 120 DAF fruits treated with methyl jasmonate 2μM (MJ). The highest concentration of Cav occured in the perisperm of 120DAF fruits (284% higher than in 90DAF) decresing at 150DAF and 396% more Caf in 120DAF than 150DAF. There is an inversion in the Caf and Cav concentrations from the bud flower and flower (Caf prevalence) to fruits (predominantly Cav). Diterpene concentration on 120DAF fruits (120DAF) treated with 2μM of methyl jasmonate (MJ) was determined after 24, 48 and 96 hours. After 48 hours, MJ-treated fruits showed an increase of 48 and 19% of Caf and Cav, respectively, when compared to untreated fruits. In this study we also identified 84 Cyt P450s transcriptionally active in Coffea spp., from the Brazilian Coffee Genome Consortium (EST sequences). Eight candidate genes were chosen for further transcriptional analysis (qPCR) in leaves, flowers and fruits at three developmental stages (90DAF, 120DAF and 150DAF). Seven genes displayed differential expression among tissues. The contigs C22_1 and C25_1 had preferential expression in leaves and showed low transcriptional activity in other tissues. Moreover the contigs C19_2, C28_1 and C37_2 had a high relative expression in flower while the contigs C33_1 and C107_1 showed a major expression in fruits with 90DAF. These last five contigs have a great potential to be involved in the final stages of Caf and Cav metabolic pathway