Purificação e caracterização estrutural de proteases produzidas pelo fungo entomopatogênico Beauveria bassiana CG432 ativado em insetos broca-do-café

Beauveria bassiana é um fungo entomopatogênico isolado de insetos mortos na natureza e tem sido amplamente estudado devido a sua capacidade de infectar e matar várias espécies de insetos. Os fungos apresentam uma vantagem em relação a outros entomopatógenos, pois não precisam ser ingeridos para causar a infecção. Conídios infectantes penetram no exoesqueleto do inseto por meio da ação de enzimas hidrolíticas como proteases, quitinases e lipases produzidas em resposta a constituição da cutícula do inseto. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar as proteases extracelulares produzidas pela cepa brasileira de B. Bassiana CG432 previamente reativada em adultos de broca-do-café (Hypothenemus hampei). Para obtenção das proteases, a cepa CG432 foi cultivada em meio líquido basal contendo 1% de glucose, 0,5% de extrato de levedura e inoculadas a 1% com uma suspensão 108 conídios/mL, a 28ºC e 150 rpm. Os cultivos foram interrompidos no terceiro dia. A purificação e caracterização das proteases extracelulares foram realizadas por ultrafiltração e cromatografia de exclusão molecular em gel Sephadex G-100. A atividade das proteases foi determinada em tampão glicina-NaOH 5 mM pH 9,5 por detecção de peptídeos solúveis liberados a 37ºC/30 min sobre soro albumina bovina pelo método de Hartree. O fator de purificação obtido foi de 43, massa molecular de 23 kDa e 26 kDa por meio de eletroforese bidimensional PAGE-SDS, e ponto isoelétrico de 4,5, 56 % de ácido aspártico por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa ODS-C18 e eluente tampão acetato-metanol (38:62). As proteases foram caracterizadas como serino proteases, com resíduos de cisteína, pois foram inibidas por fluoreto fenil-metil-sulfonil e ácido p-cloromercúriobenzóico. As proteases do Pico II apresentaram Km 4x10-4 M sobre substrato tipo-subtilisina.Beauveria bassiana is an entomopathogen fungi isolation of death insects in nature and have been widely studied which had its capacity of infect and killing many insects species. Fungus present advantage regarding to other entomopathogens, therefore they do not need to be ingested to cause infection. Conidia to infect penetrating in insect exoeskeleton by hydrolytic enzymes action as proteases and chitinases and lipases produced in response organization insect cuticle. The objective of this work was purified and characterizes extracellular proteases produced by the strain Brazilian B. bassiana CG432, previously reactivated on adults of coffe berry borer (Hypothenemus hampei). To obtainment proteases the strain CG432 was cultivated in basal liquid medium containing 1% glucose and 0.5% yeast extract and inoculated 1% with a suspension 108 conidia/mL, at 28ºC, at 150 rpm. The cultures were interrupted in third day. The purification and characterization from structure of extracellular proteases was realizated by ultrafiltration, chromatography in gel Sephadex G-100. The activity proteases in buffer glycine-NaOH 5mM pH 9.5 for detection of free soluble peptídeos liberated 37ºC/30min on serum bovine albumen for the method of Hartree. The factor of purification obtained was 43, molecular mass of 23 and 26k Da by means of eletroforese bidimensional PAGE-SDS, and isoelectric point of 4.5, 56 % of acid aspártic for liquid chromatography of high efficiency in column reversa phase ODS-C18 and eluente buffer acetate-methanol (38:62). The proteases were characterised proteases serine with residue cysteine on the basis of inhibition by phenylmethylsulphonyl fluoride and p-chlormercuricbenzoic acid. Peak II proteases showed Km 4x10-4 M on subtilisin-like substrate