Antibacterial activity of eugenol on growth and biofilm formation of Streptococcus agalactiae, and synergistic interation with silver nanoparticles produced by Fusarium oxysporum

Streptococcus agalactiae (estreptococo do grupo B EGB) é um importante agente de infecções em recém-nascidos associadas à colonização vaginal materna. A doença neonatal de início precoce pode ser prevenida com a antibioticoterapia profilática intraparto (API) para as mulheres colonizadas por EGB. Penicilina e ampicilina são os fármacos de primeira escolha, sendo que, no caso de resistência ou alergia, recomenda-se o uso de clindamicina, eritromicina e vancomicina. No entanto, a resistência de EGB, in vitro, à clindamicina e eritromicina é crescente em diversos países. Além disso, o desenvolvimento de vacinas contra EGB ainda está em progresso, o que indica que novas alternativas terapêuticas, seguras e eficazes, devem ser desenvolvidas para prevenir a transmissão dessa bactéria. Os produtos naturais são fontes promissoras de novas substâncias para tratamento das infecções causadas por patógenos resistentes, sendo o eugenol um dos compostos mais estudados e amplamente utilizado por suas propriedades medicinais. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade antibacteriana in vitro do eugenol contra S. agalactiae e analisar o efeito da combinação deste composto com nanopartículas de prata produzidas por Fusarium oxysporum (AgNPbio). Foram testadas seis amostras clínicas e uma cepa de referência (ATCC 13813) de S. agalactiae. A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizada pelo método de microdiluição em caldo e para a Concentração Bactericida Mínima (CBM), foram retirados 10 μL dos poços onde não havia crescimento bacteriano e inoculados em ágar sangue (AS). A faixa de concentração avaliada para o eugenol foi de 0,015% a 1%. A CIM e a CBM variaram de 0,125% até 0,5%. A determinação do efeito bactericida tempo-dependente do eugenol foi realizada pela análise da curva de morte, determinando a contagem de UFC em placa de AS. Nenhuma unidade formadora de colônia foi detectada após 2, 4 e 10 h de incubação na presença de concentrações de eugenol iguais às respectivas CIMs para as amostras EGB 89, EGB 121 e a cepa de referência, respectivamente. Após 10h de exposição ao eugenol, as células de EGB tratadas apresentaram coloração vermelho fluorescente, utilizando o Kit LIVE/DEAD baclight (Molecular Probes) indicando bactérias mortas em contraste com as células não tratadas verde - fluorescentes. A combinação do eugenol com AgNPbio mostrou efeito sinérgico para todas as amostras de EGB estudadas, provocando redução de 4 a 8 nos valores de CIM do eugenol e de 4 a 256 vezes para AgNPbio. As alterações morfológicas e ultraestruturais provocadas pelo eugenol foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura e de transmissão e mostraram células tratadas fragmentadas, apresentando extravasamento do conteúdo celular, além de alterações na morfologia bacteriana, rompimento da parede celular e diminuição da eletrodensidade celular. Eugenol apresentou efeito inibitório na viabilidade de células sésseis, como mostrado pelo ensaio de redução do XTT, tanto durante a formação dos biofilmes, com SMIC100 variando de 0,06% a 0,5%, como sobre biofilmes maduros, com SMIC50 variando de 0,02% a 0,25%. Os resultados obtidos neste estudo comprovam a efetividade do eugenol contra células planctônicas e sésseis de EGB, reforçando o potencial deste composto como um antibacteriano adicional no tratamento da colonização vaginal materna.Streptococcus agalactiae (group B streptococcus - GBS) is an important agent of infections in newborns associated with maternal vaginal colonization. Neonatal early onset disease can be prevented with intrapartum antibiotic prophylaxis (IAP) in women colonized with GBS. Penicillin and ampicillin are the first choice-drug, and erythromycin, clindamycin and vancomycin are the agents recommended in cases of pregnant colonization with beta-lactams resistant GBS or beta-lactams-allergy. However, resistances to erythromycin and clindamycin among GBS isolates have emerged in different regions of the world. Furthermore, the development of vaccines against GBS is still in progress, indicating that new safe and effective therapeutic alternatives should be developed to prevent the transmission of this bacterium. Natural products are potential sources of new substances for the treatment of infections caused by resistant pathogens and eugenol is one of the most studied compounds and widely used for its medicinal properties. The aim of this study was to investigate the in vitro antibacterial activity of eugenol against S. agalactiae and analyze the effect of the combination of this compound with silver nanoparticles produced by Fusarium oxysporum (AgNPbio). Six clinical strains of S. agalactiae and the reference strain S. agalactiae (ATCC 13813) were tested. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of eugenol was determined by broth microdilution method and for the minimum bactericidal concentration (MBC), the content from the wells (10 μL) showing no growth were transferred to Tryptic Soy Agar (TSA) containing 5% sheep blood plates. The concentration range evaluated to eugenol was 0.015 % to 1 %. The MIC and MBC ranging from 0.125 % to 0.5 %. The determination of time-dependent bactericidal effect of eugenol was performed by time- kill curves determining the CFU counts in TSA plus 5% sheep blood plates. No colony forming unit were detected after 2, 4 and 10 h of incubation in the presence of eugenol concentrations equal to the respective MIC for samples GBS 89, GBS 121 and the reference strain, respectively. After 10 h exposure, the GBS cells treated with eugenol presented red fluorescent staining, by using LIVE/DEAD® BacLight staining kit, indicating dead bacteria in contrast to green fluorescent untreated cells. The combination of eugenol with AgNPbio reduced significantly the MIC values of both compounds for all studied GBS strains, causing decrease of MIC values by 4 to 8 for eugenol and 4 to 256 fold for AgNPbio. The morphological and ultrastructural changes caused by eugenol were analyzed by scanning and transmission electron microscopy and showed fragmented treated cells, with leakage of cytoplasmic contents, in addition to changes in bacterium morphology, disruption of the cell wall and decreased in eletron cell density. Eugenol showed inhibitory effect on viability of sessile cells, as analyzed by XTT reduction assay, in both during the formation of biofilms with SMIC100 ranging from 0.06 % to 0.5%, and on mature biofilms with SMIC50 ranging from 0.02% to 0.25%. The results of this study prove the effectiveness of eugenol against GBS planktonic and sessile cells, reinforcing the potential of this compound as an additional antibacterial treatment of maternal vaginal colonization